海洋藻类碳水化合物活性酶数据库及研究进展

1.前言

海洋藻类生产全球约一半的初级产物，其中海洋藻类产生的海藻多糖越来越受关注。海洋中的异养微生物能将大分子的海藻多糖降解成小分子物质。这是地球上最大最快的分解代谢场所，也是碳循环中将光合作用固定的碳返还给大气中的重要途径。而且，海洋也是全球的消化池，海洋表层水（0-100m）中大部分有机物都微生物被利用。这一现象对于海洋健康和海洋气候调节至关重要，但微生物是怎样参与这一转化过程，尤其是在分子水平上并不清楚。例如，海洋基因组和宏基因组库中的基因比陆生植物中的基因表达出多了20%的未知结构和功能的假定蛋白或“孤儿”蛋白。无数与藻类有关的微生物中所含未开发的酶，如有糖苷水解酶（GH）和多糖裂解酶（PL）都参与重要的代谢途径，其特征为海洋碳循环提供新理论依据。

碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active enZymes, CAZy）是一大类很重要的酶，分为糖苷水解酶类、糖基转移酶类、多糖裂解酶类以及糖酯酶类，具有降解、修饰及生成糖苷键的功能。碳水化合物活性酶数据库是由碳水化合物活性酶(CAZymes) 组成，根据在蛋白家族中有共同的前体，目前分为133个GH家族，33个PL家族。近些年对海藻多糖降解酶研究越来越多。第一个获得三维立体结构的酶是k-卡拉胶酶，该酶是从能利用含卡拉胶培养基的海洋细菌Pseudoalteromonas carrageenovora中分离获得。该酶属于庞大的GH16家族成员，该家族中有陆生酶和海洋酶。目前已鉴定海藻多糖水解酶分别在GH和PL家族中，β-琼胶酶在GH50，GH86，GH118中，i-卡拉胶酶在GH82，α-琼胶酶在GH96，GH117中，海藻酸盐裂解酶在PL7，PL15，PL17中。

随着降解海藻多糖的已知和假定酶愈来愈受关注，弄清酶的特异性、酶识别海藻多糖结构的分子学基础、酶切割海藻多糖糖苷键的生化基础等问题非常重要，有助于理解微生物是如何利用数亿吨海藻多糖，也可预测未来海洋系统的变化。更重要的是，这一研究为产生具有治疗效果的寡糖的提供工具，为利用藻类作为原料进行再生产增加催化剂。

2.海洋藻类降解酶在生物提炼方面的应用

海洋藻类是代替陆生植物最具前景的原料。藻类生长快、不占耕地，而且藻类细胞壁多糖形成凝胶后，比纤维素更易被酶水解。海藻细胞壁含40%多糖，根据海藻类型不同海藻多糖的成分分为琼脂糖、紫菜聚糖、海藻酸盐、石莼多糖等，大部分都能形成水凝胶。最近，从Vibrio splendidus 12B01中获得的降解海藻酸盐酶基因成功导入到大肠杆菌中表达，利用微生物将褐藻中的海藻酸盐转化成高产量的生物乙醇。这一例子证明海藻多糖降解酶在生物能源方面的应用很有潜力。这一过程将海藻酸盐转化为生物燃料，扩宽了利用其他海藻多糖的途径。因此需弄清微生物分泌的海藻多糖降解酶的结构和功能特征。

3.降解红藻的水解酶系

红藻多糖的主要成分是琼脂或卡拉胶。对卡拉胶酶的研究最早最广泛。尽管β-琼胶酶研究很早，但它的结构研究如同α-琼胶酶的发现和表征，是近几年才开始。

琼脂是由L-半乳糖经α-1,3糖苷键与D-半乳糖连接。琼脂糖是由3,6-内醚-L-半乳糖（LA）与D-半乳糖连接，紫菜多糖是由L-半乳糖-6-硫酸与D-半乳糖连接（L6S）.琼脂糖中的新琼二糖和紫菜多糖中的新紫二糖都是由β-糖苷键连接。根据所降解糖苷键不同，将海洋微生物多种酶分为β-糖苷键酶和α-糖苷键酶。

3.1 琼脂糖的降解

目前，β-琼胶酶属于GH16、GH50、GH86、GH118家族成员，而α-琼胶酶属于GH96、GH117家族成员。这些酶结构特征属于GH16、GH50、GH117家族成员。

3.1.1 GH16家族内切β-琼胶酶

来自海洋细菌Zobellia galactanivorans 所产生的ZgAgaA和ZgAgaB 是最先确定其三维结构的两种酶。这两种酶属于GH16家族成员，具有β-jelly-roll-fold 结构，保留异头碳的立体化学,利用两个催化谷氨酸残基为催化水解的机制。像该家族中功能相关的其他成员一样，这两种酶是内切型酶，以新琼四糖和新琼六糖为终产物，这与ZgAgaA , ZgAgaB, 和 ZgAgaD 中约30个氨基酸开放结合槽有关。取代度为四到六的寡糖很难再被GH16家族中的琼胶酶降解，需加入其他酶才能完全降解琼胶系统。所加酶为GH50家族的β-琼胶酶和GH117家族α-琼胶酶才能实现。

3.1.2 GH 50家族外切β-琼胶酶

GH 50家族β-琼胶酶将琼脂糖降解成新琼二糖或新琼四糖。从Saccharophagus degradans 2–40 获得的Aga50D 能识别新琼寡糖的非还原末端生成新琼二糖，因此能继续进行GH16家族β-琼胶酶终止的反应。Aga50D是该家族中首个确定结构的酶，根据酶与底物和产物二糖的两个复合结构认为存在两个结构域，一个是(β/α)8-barrel fold 的催化结构域，另一个是类似β-jelly roll fold的碳水化合物结合结构域 (CBM)。位于催化域的两个谷氨酸出现在隧道型活性位点底部，CBM将短小片段连接到催化域。而Aga50D中类似的CBM在隧道型活性位点入口与催化域结合，通过色氨酸残基与底物连接延长底物结合缝。

3.1.3 GH117家族中α-琼胶酶（新琼二糖水解酶）

GH117家族中α-琼胶酶为外切型酶，能切除新琼寡糖非还原末端的3,6-内醚-L-半乳糖。GH117家族中首个确认结构的α-琼胶酶是来自海洋细菌Z. Galactanivorans所产生的酶 ，随后又从S. degradans 2–40 鉴定到该家族中的α-琼胶酶。这些结构表明酶有5片β-螺旋桨折叠，通过域对换形成稳定的二聚体。GH117 家族中第三个确认结构的是来自人肠道细菌Bacteroides plebeius 提取BpGH117酶，通过该酶与新琼二糖的复合体证实了β-螺旋桨中心有活性位点存在，活性位点邻近的是金属离子结合位点，到目前为止，金属离子结合位点的作用并不清楚。对这种结构解释认为活性部位结合定点突变架构最符合一个反转异头配置的催化机理。在该酶的机制中 组氨酸的侧链提供质子，天冬氨酸（aspartate ）作为受体。组氨酸紧密连接天冬氨酸，在Bacillus subtilis 中形成Asp-His 相似的N-乙酰谷氨酸酶，传递系递送质子到离去基团上。

许多海洋微生物包含多重同源基因，能编码出GH117、GH86、GH50、GH16家族的酶，当内切-β-琼胶酶、外切-β-琼胶酶、外切-α-琼胶酶组成系统出现，就能将多糖降解成单糖。多基因家庭的频繁出现可能反映了对琼脂异质性适应,这可能会导致CAZyme亚科适应趋异。

4. 紫菜聚糖的降解

第一个紫菜聚糖酶是在Z. galactanivorans 发现，是GH16家族成员。这类酶除了特异性识别紫菜聚糖的硫酸基团外，其他性质与琼胶酶很相似。在人肠道细菌B. plebeius 中发现Z. galactanivorans 分离的紫菜聚糖酶的同源基因，因此GH86家族中首个β-紫菜聚糖酶结构和功能上可借鉴同源基因。

4.1 GH86家族的β-紫菜聚糖酶

来自B. Plebeius的BpGH86A 具有内切-β-紫菜聚糖酶活性，最初该家族中的特异性酶认为是由β-琼胶酶主导。该酶采用(β/a)8-barrel fold 和两个辅助的β-三明治结构域。在紫菜聚糖复杂的产物结构中，产生了与琼脂糖降解的六聚物相似结构(L6S-G-LA-G-L6S-G~) ，表明催化谷氨酸排列与异头构像保留的催化机制一致。BpGH86A 中-2亚位点与L6S 残基和其6-硫酸基团作用，使BpGH86A选择性的识别紫菜聚糖。编码基因的BpGH86A对多糖利用轨迹与GH16家族中的紫菜聚糖酶和其他能降解琼脂的酶一样。研究B. Plebeius的基因簇生物化学、结构功能表明该酶使细菌功能性的代谢紫菜聚糖。与B. plebeius紫菜聚糖酶高度相似的基因簇在海洋细菌中发现 ，支持了功能性碳水化合物的降解能从环境细菌转移到人类肠道微生物的假设。

海洋酶的一个共同特征是能特异性识别海藻多糖中的硫酸化修饰。图3表明多种海洋β-卡拉胶酶（a-d）和β-紫菜聚糖酶（e-h）的硫酸酯键的识别口袋。这些结构表明改变酶活性位点能特异性识别带负电荷的硫酸基团，活性位点的基础残基通常为精氨酸。除B. plebeius的GH86家族β-紫菜聚糖酶外（e,f），目前所报道的硫酸基底物与酶的复合物结构中，是由精氨酸的胍基通过氢键与硫酸基连接。而在BpGH86 中是由位于不同亚位点组氨酸和赖氨酸通过氢键与硫酸基连接。另一个显著特征是,这些酶的催化槽本该与中性多糖结合而减少疏水表面的暴露,但与之矛盾的是,识别带电硫酸基的特异性口袋至少包含一种疏水残基。

5. 褐藻裂解酶系统

在海洋生态系统中褐藻是产量最高藻类。海藻酸盐是由D-甘露糖（M）和C5的差向异构体α-L-古罗糖醛酸经β-1,4糖苷键连接，是褐藻细胞壁的主要多糖。同质单体组成pM,pG,或形成杂聚的pMG。海洋细菌通过海藻酸盐裂解酶和海藻酸寡糖裂解酶降解海藻酸。这类酶属于糖苷裂解酶（PL）家族成员，通过β-消除反应去除糖苷键。

5.1 海藻酸盐裂解酶

目前，已经获得PL7 、PL14、PL15、PL17家族海藻酸盐裂解酶的结构。PL7家族酶降解海藻酸盐与GH16家族酶降解琼脂糖相似，在胞外酶先经内切将海藻酸盐降解成寡糖，再将寡糖移入胞内。PL7裂解酶采用的是β-jellyroll fold 形成底物结合槽，跨越整个酶。然而，也有报道表明PL家族中也存在外切活性酶。在这样的结构中，属于PL7家族中源于Z. galactanivorans 的两个酶AlyA1 (PDB 3ZPY)和 AlyA5 (PDB 4BE3) ，但这两种酶显示了互补的反应模式。AlyA1 是内切酶，专一性降解古罗糖醛酸片段，主要生成三糖和四糖，而AlyA5 是外切酶，能降解海藻酸盐寡糖和多糖链的非还原末端，生成不饱和单糖。这样的作用互补方式与酶的结构一致，AlyA1 延伸开放的底物结合缝，而AlyA5 的活性位点形成结合口袋；AlyA5序列嵌入的特征环环绕在活性位点和接合缝的一边。经PL7家族酶降解成的寡糖进入周间质，再被PL15、PL17家族的胞内外切寡糖酶进一步降解。

5.2 PL15、PL17家族中海藻酸盐寡糖裂解酶

寡糖裂解酶是将经海藻酸盐裂解酶降解成寡糖后进一步彻底降解。2010年报道了第一个寡糖裂解酶，是来自Agrobacterium tumefaciens 的Atu3025 。PL15家族酶采用的是含有(α/α)6-barrel 结构域和反平行的β-折叠组成的双分子结构。不活跃的Atu3025突变体结合底物的结构表明该酶位于两个结构域交界处的三个底物结合亚位点组成的活性口袋能识别海藻酸盐链的非还原端并将其切成单糖。远离该酶处有一开放的结构域，而与底物结合经历了构象变化，能折叠底物形成类似活性位点的口袋。~10的构象改变锁住了位于两个酪氨酸之间处于-1亚位点的古罗糖醛酸。这一运动改变组氨酸残基和络氨酸残基分别作为催化基质和酸在+1亚位点结合糖残基和糖苷键结合，让催化机制位于正确的位置，从而使酶降解底物。

首个被确定PL17家族酶结构是从海洋细菌S. degradans 的Alg17c 酶。尽管该酶与陆生的PL15家族成员序列相似的仅10%，但Alg17c也采用了相似的(α/α)6-barrel 和反平行的 β-sheet 结构。从Alg17c中Tyr 到Ala 的，尤其是不同侧链，特别是两个酪氨酸，突变体活性位点与底物的结合结构中，提供催化酸和基质。PL17家族酶另一个显著不同还包括结构金属离子存在，而在PL15家族中没有。

6.第一个降解绿藻多糖酶

石莼是一种绿藻，以固着或浮游形式获得光照和营养。绿藻的高生长率和高产率因影响水产养殖造成重大的经济影响或因海滩有大量的绿藻分解物污染而阻碍旅游业发展。尽管高生长率，高产率让含丰富碳水化合物的藻类令人讨厌，但也认为绿藻可作燃料的原料。石莼的主要基质多糖为石莼聚糖，石莼聚糖是3-硫酸-鼠李糖(Rha3S)，葡萄糖醛酸，(GlcA), 艾杜糖醛酸(IduA), 木糖 (Xyl) 组成的阴离子多糖。筛选降解绿藻多糖的海洋微生物酶是解决绿藻作为原料的关键。

6.1 GH105家族降解石莼聚糖酶

在微生物能利用石莼聚糖的生物勘探项目中，从海洋腹足动物海兔的排泄物中分离筛选出一株能明显降解石莼聚糖的菌株。在该菌的发酵液中添加石莼聚糖，离心后的上清液中经鉴定存在两种石莼聚糖裂解酶，经基因编码克隆重组蛋白得以表征。对石莼聚糖裂解酶基因的探索发现该基因与分类在CAZyGH105家族中的不饱和糖醛基水解有很高的相似性。该家族中首个石莼聚糖降解酶的晶体结构表明该酶具有(a/a)6 fold 结构。这个不饱和β-葡糖醛酸水解酶能水解石莼聚糖裂解酶所生成的寡糖。有趣的是，该酶对β-构象的底物有活性，而该家族中其他所有成员并无此特性。作者认为由于糖苷键的识别不是催化机制的一部分，缺乏多特异性残基轴向或赤道向构型的选择压力解释了该家族的两个特异性。因此，在这个例子中催化水解的发生是通过水补充了C4-C5间不饱和键，随后分子重排，最终导致糖苷水解酶切除。再次，这个例子也证明了随着GH家族中代表结构和特征成员的增加，建立起模型或规则的例外也增多。

8.结论

随着生态和生物技术的发展，对生物量转化兴趣日益增加，使得对海洋CAZy 酶的生化和结构表征上的研究增多。对于一些主要的海藻多糖，例如琼脂或海藻酸盐，提供了对所有酶将多糖降解成单糖最前沿的观点。然而，最近的基因组和宏基因组数据认为我们离海藻多糖降解酶系统的多样性和复杂性还很远。尤其是寡糖和多糖水解酶对于许多海藻多糖特别是微藻类仍需继续鉴定。微藻爆发的宏基因组学和蛋白质组学的研究与已鉴定>20种GH和PL家族的微生物群落和酶类相关 ，这些特征作为在海藻爆发期消化和利用海藻多糖的不同细菌的分类依据。然而，大多数推断CAZymes的底物并不清楚，因此酶的表征对于理解其在海洋碳循环的重要作用十分重要。