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    造血干细胞动员和采集对正常供者的影响
    陈晓霞;王智明;罗贤生;徐丹丹;李兴;雷美清
    【摘要】背景:粒细胞集落刺激因子动员是当前健康志愿供者采用的主要方法.据国内外文献报告:在粒细胞集落刺激因子动员中已发生少数严重不良反应,这引起了国人对中国非血缘健康供者安全的忧虑.粒细胞集落刺激因子作为动员剂对健康志愿供者有何影响?是否安全?目的:观察粒细胞集落刺激因子对正常供者的影响.方法:选择2003-01/2008-12在海口市人民医院接受粒细胞集落刺激因子5～10μg/(kg·d动员剂进行外周血造血干细胞捐赠者16例,观察动员及采集过程的不良反应,检测动员前后血常规CD3、CD19、CD3+4、CD3+8细胞比值在动员前后变化,并随访所有供者.结果与结论:10例供者在重组人粒细胞集落刺激因子动员过程中无任何不适,有3例出现低热,头痛、肌肉及骨骼疼痛、腰痛等,3例供者出现发热,其严重程度均在Ⅰ级,但无需终止动员.白细胞经重组人粒细胞集落刺激因子动员后数量较动员前升高,停止动员后3d全部供者的白细胞恢复至动员前水平.血红蛋白、血小板、CD3、CD19、CD3+4、CD3+8细胞比值在动员前、动员后72,96h无明显变化.提示健康供者可耐受粒细胞集落刺激因子5～10μg/(kg·d,动员和采集过程;且对T细胞亚群无影响.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷,期】2010(014023【总页数】4页(P4281-4284
    【关键词】粒细胞集落刺激因子;造血干细胞;供者;动员;安全性【作者】陈晓霞;王智明;罗贤生;徐丹丹;李兴;雷美清

    【作者单位】中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院血液科,海南省海口市,570208;中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院血液科,海南省海口市,570208;中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院血液科,海南省海口市,570208;中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院血液科,海南省海口市,570208;中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院血液科,海南省海口市,570208;中南大学湘雅医学院附属海口市人民医院血液科,海南省海口市,570208【正文语种】中文【中图分类】R394.20引言
    异基因造血干细胞移植(allogeneichematopoieticstemcelltransplantation，allo-HSCT已成为治疗多种血液病及非血液系统疾病的主要手段之一，找到合适的造血干细胞供者是成功进行造血干细胞移植的前提。Allo-HSCT的首选供者是HLA配型全合的同胞兄弟姐妹，次选非血缘配型全合供者、人类脐带血造血干细胞及亲属HLA单倍体供者。美国的统计资料显示只有不超过40%的患者可以找到HLA相合的同胞供者[1-2]。国内单生子女在新一代中，亲缘供者不足10%。临床上对非血缘健康供者的造血干细胞需求日益增加。
    在非血缘健康志愿供者捐赠外周血造血干细胞的动员过程中，外周血造血干细胞动员采集的安全性意义重大。随着国内造血干细胞资料等的扩大和供受者间HLA配对成功率的上升，非血缘供者的安全性日益受到重视。CD34+抗原主要表达在早期造血干、祖细胞上，占正常人骨髓单个核细胞的1.5%左右，外周血中量极少。它具有很强的扩增能力及自我更新能力，是实现造血重建的细胞，应用粒细胞集落刺激因子(granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF后可使外周血干细胞
    量增加，并且自我更新，复制能力增强[3]。G-CSF动员是当前健康志愿供者采用的主要方法。据国内外文献报告：在G-CSF动员中已发生少数严重不良反应，这引起了国人对中国非血缘健康供者安全的忧虑。G-CSF作为动员剂对健康志愿供者有何影响？是否安全？
    提高外周血干细胞动员的安全性，避免严重不良事件的发生，显得非常重要，以有利于非血缘健康志愿者供者队伍的壮大。本文对16例经动员的健康供者的临床、血象及细胞亚群进行观察，探讨G-CSF作为异基因造血干细胞动员剂的安全性.。1对象和方法
    设计：回顾性病例分析。
    时间及地点：实验于2003-01/2008-12在海口市人民医院完成。
    对象：选择在海口市人民医院进行的异基因外周血造血干细胞捐赠者16例，男11例，女5例，中位年龄24岁(18～46岁，体质量41～60kg。捐赠者对本试验均知情同意，试验方案经医院医学伦理委员会批准。技术路线：
    动员：采集健康供者的自体外周血干细胞，分析采集时机与效率。16例捐赠者接受rhG-CSF5～10µg/(kg·d，皮下注射5d动员造血干细胞，第4天及第5天为采集日，每例捐赠者进行2次采集。
    采集：采集时使用COBESpectra6.0血细胞分离机的全自动干细胞采集程序。16例捐赠者采集量(HarvestVolume4.0～5.0mL，推赶量(ChaseVolume3～5mL。每例2次采集的采集量及推赶量均相同(即两组的采集量及推赶量均相同。每次采集流速为34～45mL/min不等，血与抗凝剂比值为12∶1。总循环血量6.7～10.1L。
    CD34+细胞的测定：部分标本是在本院采用FACSCalibur型流式细胞仪检测。有核细胞与CD34+单抗室温下避光混合30min。测定动员前后外周血和采集物
    中CD34+细胞的百分含量。也有部分标本是在外院用贝克曼公司流式细胞仪及BD公司流式细胞仪国产CD34+单抗检测，故未进行分析。
    单个核细胞及白细胞计数：每例2次采集的采集量及推赶量均一样，故以单个核细胞及白细胞浓度作为比较的指标。单个核细胞及白细胞的检测均由专人负责，采用全自动血液自动分析装置(XT-2000及手工复核。
    设计、实施、评估者：试验设计为第一作者，干预实施、评估为全部作者，均受过专业培训，未采用盲法评估。
    主要观察指标：供者在rhG-CSF动员与分离过程中、后出现的不良反应并按WHO毒副作用分级标准评价和记录出现的不良症状，及其消失时间、缓解方式。本组病例均进行追踪随访，每例均于采集后1，3，6，9，12，24，36个月，进行电话随访。
    统计学分析：由第一作者采用SAS8.0软件完成统计处理，计量资料以表示，不同时间段的比较采用配对t检验，P＜0.05为差异有显著性意义。2结果
    2.1动员与采集所有供者均按计划完成动员采集。总循环血量1L，采集的单个核细胞(6～12×108/kg，CD34+细胞数(3～34×106/kg。2.2健康供者的一般特征及不良反应见表1。
    表1健康供者的一般特征及不良反应Table1GeneralcharacteristicsandadversereactionofhealthydonorsG-CSF:granulocytecolony-stimulatingfactorDonorGenderAge(yrVolume(mL1Male2158.5300-450No2302Male2763300No2803Female1945300No11774Male2360300-600Low-gradefever,boneandmusclepainWeight(kgG-CSFdose(µg/dAdversereactionWHOgrade13185Female1950300Low-gradefever,headache11617Male3263300-600No2368Male2355
    300No1989Male3658300-600No21710Male2156300Low-gradefever18711Male4466300No21812Female3169300-600Low-gradefever,boneandmusclepain12156Female2245375-450Low-gradefever,lumbago18613Male2977300-450No21414Female4850300Low-gradefever,boneandmusclepain18615Male2640300-450No20616Male2052300-450No18710例供者在rhG-CSF动员过程中无任何不适，有3例出现低热，头痛、肌肉及骨骼疼痛、腰痛等，3例供者在动员过程中出现发热，其严重程度均在Ⅰ级，但无需终止动员。停止动员后3d，上述症状均消失。4例健康志愿者供者在采集过程中出现不同程度的四肢、口唇及颜面麻木，经口服钙剂症状缓，有1例静脉补充钙剂。未出现抽搐、出血。
    2.3血象与T细胞亚群变化见表2。
    表2动员前后血象及淋巴细胞亚群变化情况Table2Changesincompletebloodcountandlymphocytesubsetsbeforeoraftermobilization(P1:acomparisonbetweenpre-mobilizationand72hofmobilization;P2:acomparisonbetweenpre-mobilizationand3dfollowingstoppingmobilizationPost-mobilizationIndexnPre-mobilization72h96hLeukocyte(×109/L165.53±2.3835.85±10.4430.80±13.39Hemoglobin(g/L16134.00±28.23133.0±22.72129.70±28.48Platelet(×109/L16227.28±41.66209.14±55.60126.43±24.24CD3(%868.00±5.3573.50±2.6571.30±2.52CD19(%812.33±2.9414.00±5.0015.50±6.55CD3+4(%840.50±4.5040.30±6.0339.25±4.72CD3+8(%834.75±5.6833.75±6.6530.75±0.96CD16+56(%819.75±3.3114.75±3.4015.50±4.12Indexn3dfollowingstoppingmobilizationP1P2Leukocyte(×109/L16
    8.16±1.65＜0.0001＞0.05Hemoglobin(g/L16153.75±7.32＞0.05＞0.05Platelet(×109/L16139.25±62.54＞0.05＞0.05CD3(%8＞0.05CD19(%8＞0.05CD3+4(%8＞0.05CD3+8(%8＞0.05CD16+56(%8＞0.052.4正常供者的追踪观察所有供者均健在，无不适。3讨论
    目前异体外周血干细胞动员以单用G-CSF为动员剂。G-CSF动员是当前采用的主要方法，欧洲血液和骨髓移植组推荐剂量为10µg/kg，连续4～6d，即可得到足够的造血干细胞。G-CSF应用于临床后，多项研究报道证实其作为动员剂是安全有效的，国际骨髓移植委员会(IBMTR分析了1994/1997登记的785例健康自体外周血干细胞供者的材料，结果仅8例(1%有非威胁生命的并发症[4]。国内梁赜隐等[5]采取回顾性方法对431例健康供者外周血干细胞动员及采集多因素分析，观察到191例次供者有动员相关不良反应，不良反应轻微(按WHO毒副作用分级标准，动员过程中出现1级骨痛发生率20.3%，腰痛发生率19.4%，乏力发生率3.1%，无需特殊处理。供者在采集过程中无口周、脸部和手指麻木、恶心、呕吐发生率71.51%，手足抽搐呕吐发生率1.6%，供者在采集过程补充钙剂68.8%。国内李佩等[6]用G-CSF5µg/(kg·d对56例正常供者进行动员4～6d，不良反应轻微，少数供者在G-CSF动员过程中出现1级(按WHO毒副作用分级标准腰痛(10/56乏力(3/56等不良反应，无需特殊处理。供者在采集过程中无口周、脸部和手指麻木、恶心、呕吐、手足抽搐，严重者心律失常。但是，国内外目前也有文献报道少数严重不良反应。①死亡：国外有1例同胞供者动员中因为血栓形成(急性心肌梗死和卒中而死亡[7]。还有3例死者因外周血干细胞动员而诱发镰刀性贫血，出现休克，心脏骤停死亡[8]。②脾脏破裂：国外报道4例脾脏破裂[9]。国内天津报道1例同胞供者在G-CSF动员采集造血干细胞过程中发生脾破裂。③
    自身免疫疾病发作，如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、甲状腺功能减退等。④捐献干细胞后血象异常持续较长时间[10]。
    为了避免以上严重不良反应，确保供者安全，应严格地进行供者的健康检查。不应该接受脾大者、年龄偏大、有心血管疾病者，有风湿病史者、有血常规指标异常或有血象异常史作为供者。本组供者无严重不良反应，10例供者在rhG-CSF动员过程中无任何不适，有3例出现低热，头痛、肌肉及骨骼疼痛、腰痛等，3例供者在动员过程中出现发热，其严重程度均在Ⅰ级，但无需终止动员。停止动员后3d，上述症状均消失。且似乎与G-CSF注射剂量、外周血白细胞数及个体耐受性差异有关。
    关于G-CSF的使用剂量，G-CSF的应用剂量是影响外周血干细胞动员结果的主要因素之一。不同的G-CSF动员剂量在一定范围，其浓度与其对干细胞动员的效果直接相关。G-CSF动员CD34+细胞随G-CSF动员剂量增加而增加。动员的细胞数高峰一般出现在第5，6天，所以G-CSF连用5d，第5天开始采集。目前成功移植的CD34+细胞没有一个公认标准，多数一致认为CD34+细胞大于2.0×109L-1是移植的理想值。目前欧洲血液和骨髓移植中心推荐的G-CSF动员剂量为10～16µg/(kg·d，连续运用4～6d[11-12]。如Kroger等[13]对比10µg/(kg·d与16µg/(kg·d采集效果的差别，发现16µg/(kg·d组的CD34+细胞量高于10µg/(kg·d组，伴随更多的不良反应及更高的不良费用。Zhu等[14]认为G-CSF的使用剂量越大，则干细胞获得率越高，但不良反应越大。国内李佩等[6]用G-CSF5µg/(kg·d对56例正常供者进行动员4～6d，采集CD34+细胞数平均达(4.31±2.02×106/kg。采集细胞数达到植入标准，提示小剂量G-CSF动员可能为动员健康供者理想方案。本试验中G-CSF剂量为(5～10µg/(kg·d，符合推荐剂量。
    16例供者中采集次数1或2次，无采集3次以上。所有供者采集物数量均达到移
    植要求单个核细胞(个平均(6～12×108/kg。应用血细胞分离机在外周血造血干细胞采集过程中及术后，不良反应及并发症时有发生，若不注意预防和处理，将影响采集的顺利进行，甚至引起严重后果[15]。在采集过程中，需要以复方枸橼酸钠抗凝全血，枸橼酸钠螯合血液中的钙离子，引起血液中的钙离子下降。患者可出现口周、脸部和手指麻木、恶心、呕吐、手足抽搐，严重者心律失常。研究表明：如不预先在采集过程中预防性补充钙剂，低钙的发生高达50%左右[16]。目前国内外预防复方枸橼酸钠中毒症状有2种方法：①预防性或术中定期口服补充钙剂。②静脉持续按量补充钙剂。4例健康志愿者供者在采集过程中出现不同程度的四肢、口唇及颜面麻木，经口服钙剂症状缓，有1例静脉补充钙剂，未出现抽搐。
    本组供者白细胞经rhG-CSF动员后数量较动员前升高6～10倍，停止动员后3d全部供者的白细胞恢复至动员前，血小板于采集后下降，最低降至79×109L-1，临床无出血情况，采集结束后3d恢复正常。
    试验发现采集前后血小板的数值有明显改变，这与造血干细胞分离过程中大量血小板被采集细胞悬液中有关，为暂时性的血小板下降。但临床上没有发现供者的任何出血现象，亦未进行任何处置。
    目前G-CSF动员后外周血中T淋巴细胞的研究已成为热点[17]。从而可能对G-CSF动员机制进行更为深入的探讨。T细胞亚群在机体免疫上发挥着重要作用，T细胞亚群测定在移植中亦显得十分重要。异体造血干细胞移植后的移植抗宿主病及自体造血干细胞移植后免疫功能的恢复均与其密切相关。结果显示：应用G-CSF后，正常供者的T淋巴细胞亚群比例正常，其原因是G-CSF主要刺激粒细胞的增殖分化，而对淋巴细胞的数量及比例影响不大[3]。翁建宇等[18]研究报道，G-CSF动员对正常供者T细胞亚群及其表面标志物没有影响。试验结果显示供者CD3、CD19、CD3+4、CD3+8细胞比值在动员前、动员后72h及96h无明显
    变化，与国内陈松鹤等[19]的研究结果一致，即G-CSF不影响供者淋巴细胞。徐娟等[20]报道，对30例健康志愿供者皮下注射G-CSF5µg/(kg·d，连续4～6d，供者机体T细胞处理异体抗原的能力降低，当完成外周血造血干细胞采集后，上述变化在短期内恢复到用药前水平，对健康志愿供者无不利影响。
    试验通过探讨干细胞动员及采集过程中不良反应的种类和程度，总结不良反应的症状，包括骨骼酸疼、失眠烦躁、四肢肌肉疼痛、体温一过性增高、不良反应的程度轻，不影响生活质量和情绪。作者认为对于正常供者短期应用G-CSF没有明显的不良反应，16例供者中追踪观察最长已6年，现身体健康。大多数供者追踪期短，对于远期不良反应还需观察。4参考文献
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