时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程

一、产前筛查定义及其原理

产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β-绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE3）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、抑制素A（inhibin A）等。产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。

二、唐氏综合征的产前筛查

唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。目前对DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。

1.以孕妇年龄作为筛查指标

最早用于DS的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现，DS的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977年Hook和Chambers报道了孕妇年龄在20～30岁之间，发病率呈线性增加，而在33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为35岁时，发病率约1/384，40岁时约1/110，比30岁时增加了8倍，如图1。一般认为35岁以上的孕妇是DS的高危人群，是要进行羊膜腔穿刺的指征。但深入研究统计发现，若仅以孕妇年龄≥35岁作为筛查指标，DS的检出率约20%，而约80%的胎儿DS是在年龄小于35岁的孕妇人群中。因此，不少国家的筛查机构指出“DS 产前筛查应面向所有孕妇而不考虑年龄”。仅用孕妇年龄指标不够全面，应结合应用孕妇血清标志物指标或超声波形态学联合筛查诊断。

图1 孕妇年龄与胎儿发生唐氏综合征风险的关系

2. 以孕妇血清标志物为筛查指标

1984年英国Merkatz等最先发现怀有DS胎儿的孕妇血清AFP含量降低，这在产前筛查史上是一个划时代的进步，建议将AFP作为35岁以下孕妇胎儿DS的筛查指标。这一发现很快被其它实验室证实，1987年Bargot发现怀有DS胎儿的孕妇血清中的hCG的水平是正常孕妇的2倍，以孕妇年龄再结合血清中hCG检测，DS的筛查率可达到63%。1988年，Canick等发现怀有DS胎儿的孕妇血清中uE3的水平比正常孕妇低25%。同年，伦敦Bartholomews医院Wald提出AFP、ß-hCG、uE3三联的筛查方法。1994年美国妇产科学院向全美医学界正式推荐这一组合，并得到广泛应用，一直至今。在上世纪90年代，有学者还相继发现PAPP-A、inhibin A、糖原抗原125（CA-125）等与孕妇怀DS胎儿有关。也将逐步应用到DS的产前筛查中。

甲胎蛋白（AFP） 是胎儿血清中最常见的蛋白质，1956年由Bergstrandh和Czar在人胎儿血清中发现的一种甲种球蛋白。早孕期由卵黄囊产生，晚孕期由胎儿肝脏大量产生。胎儿血中的AFP经排尿进入羊水并通过胎盘屏障渗入母血。孕10周即可在母血中测出AFP，孕11～20周AFP浓度呈线性升高，32～34周（有文献为28～32周）达到高峰，以后逐渐下降，分娩后几天降为0。且孕早期以AFP单项筛查胎儿染色体异常无意义，因此母血中AFP的检测在孕中期14～20周进行。正常孕妇血中AFP含量变化见图2与表1。

当孕妇胎儿患DS时，由于胎儿生长发育迟缓，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，合成AFP能力降低，致使孕中期母血清AFP水平下降（一般<0.5MOM，有的以<0.4MOM或<0.7MOM为标准）。但当胎儿出现开放性神经管缺损或腹壁缺损时，破坏了阻止AFP外溢的胎儿屏障，使胎儿体内高浓度的AFP释放，渗透入母体循环，引起母体血清中的AFP显著升高。因此，AFP也可作为神经管畸形的筛查指标。

参考：马云宝，顾军，何雪云.医学特种检测的临床应用，第1版.北京：原子能出版社，1-2.

图2 正常妊娠母血中AFP含量变化趋势

表1 正常妊娠母血清AFP含量参考值（ug/L）

摘自：方群.妇产科检验诊断学，第1版.北京：人民卫生出版社，62.

绒毛膜促性腺激素（hCG） 是胎盘的合体滋养层分泌的一种糖蛋白，为胎盘中最重要的激素，由α和β亚基组成，两个亚基可彼此结合，也可游离于血液中。孕妇血清中的hCG主要以完整的形式存在，游离形式的β-hCG（F-β-hCG）占总hCG的1～8%。妊娠期母血清中β-hCG水平呈双峰曲线，第1峰于妊娠12周前后（一般8～10周或9～12周），15周后出现生理性下降，20～32周维持低而平稳水平，26周达最低。第2峰于妊娠37周，明显低于第1峰，至妊娠足月时稍有下降。在妊娠11周内，血清β-hCG的含量与孕龄密切相关，随妊娠进展呈直线上升，孕龄每增加1天，β-hCG平均增加1.53IU/ml（hCG约每1.3天上升2倍，如未达到此水平，此次妊娠可能是输卵管妊娠—宫外孕，应动态观察），分娩后急剧下降，产后4天降至1 IU/ml，产后9天基本消失。正常妊娠母血清hCG含量见表2与表3。

胎儿患DS时，胎盘重量低于正常水平，组织器官发育不全，肝脏、胎盘的功能不良，因此孕妇血清中hCG浓度下降要比怀正常胎儿的孕妇晚3周左右，致使孕中期（约20周左右）母血清中的hCG浓度呈高水平状态，怀DS儿孕妇血清中游离的β-hCG浓度比正常孕妇至少高2倍（一般>2.5MOM），如图3。

表2 正常妊娠母血清hCG含量参考值（U/L）

摘自：周新，涂植光.临床生物化学和生物化学检验，第3版.北京：人民卫生出版社，435.

表3 正常妊娠母血清β-hCG含量参考值（mIU/ml）

摘自：1.韦振元等.血清β-hCG、HPL和β-hCG/HPL比值对妇产科疾病的临床意义.标记免疫分析与临床，1999，6（1）：9-12.

2. 王晓雯等.孕中期各周β-hCG正常值测定及其临床意义.中国优生与遗传杂志，2000，8（2）：62.

图3 ß-hCG在正常孕妇和怀有唐氏胎儿孕妇血清中的分布

游离雌三醇（uE3） 是雌二醇（E2）和雌酮（E1）的代谢产物，在非妊娠女性中浓度很低，而在妊娠后期浓度则明显增加。只有约9%的E3在血液循环中游离为uE3。在妊娠后期E3由胎儿肾上腺、胎肝和胎盘大量合成，反映了胎儿和胎盘双方面的功能。母体血清E3约90%来自此合成途径，少量由母体卵巢前体生成。E3生物合成途径的中断将导致母体血清E3低水平。造成E3途径中断的情况：胎儿宫内发育迟缓、无脑畸形、胎盘硫酸酯酶缺乏、死胎、染色体异常等，缺乏E3的孕妇分娩期将推迟。在胎儿正常发育的情况下，其母体内uE3含量自29～34周逐渐上升，35～36周开始快速上升，在41～42周（37～38周或40～41周）达高峰，正常妊娠孕妇uE3参考值见表4与图4。

uE3被用于胎儿DS筛查主要在孕中期，应注意正常妊娠孕妇uE3是孕中期变化最大的指标，必须核对孕周。在孕妇怀DS胎儿时，母体血清中uE3表现为降低异常（一般<0.7MOM）。目前uE3已是多标记联合筛查中用得相当普遍的标记物之一。

表4 正常妊娠孕妇血清uE3参考值(±s,μg/L)

引自：徐增秀,徐燕红,彭晓燕,等.正常孕妇血清游离雌三醇动态监测的临床价值.标记免疫分析与临床,2000,7(2): 74-75.

图4 正常妊娠孕妇血清uE3含量变化趋势

妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A） 是一种大分子糖蛋白，PAPP-A由胎盘合体滋养层和蜕膜产生，属于α2巨球蛋白，具有激活补体，起免疫抑制的作用（其生物功能目前尚未完全清楚）。早在1974年Lin等首次报道了孕早期母血中PAPP-A的研究，指出PAPP-A起源于绒毛周围纤维蛋白，其水平随孕周增加而增加。后来诸多学者分别在孕早期应用PAPP-A结合F-β-hCG（或hCG）作为DS筛查指标，证实PAPP-A是一种最有意义的标志物。Wald等及Haddow等在综合归纳了9个国家21个产前筛查诊断中心的研究结果的基础上，用孕妇7种血清标志物以不同组合作筛查指标进行比较，结果显示，PAPP-A诊断DS效果较满意，特别是结合F-β-hCG组合时阳性检出率可达60%，其中假阳性率仅为5%。Zimmermann等检测了1151例21三体和18三体患者的PAPP-A水平，中位数的倍数分别是0.51和0.08 ，结果显示PAPP-A可作为妊娠DS胎儿产前筛查一个独立的标志物。

孕早期就可以在母体血清中检测到PAPP-A（单胎受精后32天，双胎受精后21天即可在孕妇血清中检测到），随着妊娠进展，母体PAPP-A水平升高，到妊娠足月时达到高峰，此时母血PAPP-A浓度是羊水的10倍，产后6周即测不到。而整个妊娠期间，胎血中测不道PAPP-A，这是因为PAPP-A分子量大，不能透过胎盘进入血循环。PAPP-A具有以下优点：在孕早期阶段，母血中即可测到。当其他妊娠蛋白水平开始下降时，母血PAPP-A水平仍在升高，它是唯一的一种在母血中浓度最高，羊水中次之，胎血中不含有的妊娠蛋白。由于DS胎儿的器官包括胎盘均发育不全，胎盘合体滋养层功能下降，合成PAPP-A减少，因此怀有DS胎儿的孕妇，其血清中PAPP-A一般低于0.25MOM～0.51MOM。在孕早期低水平的PAPP-A是筛查染色体异常胎儿的很好指标，尤其是DS胎儿，阳性检出率可达66％。此外，有自然流产、异位妊娠、胎儿生长迟缓、胎死宫内时，孕妇血清PAPP-A亦呈低值，这与胎盘功能不全，使其合成减少有关。正常妊娠孕妇血清PAPP-A参考值见表5与图5。

该指标在孕早期较为敏感，检测PAPP-A前最好以B超检查确定孕龄，孕14周后21三体妊娠与正常妊娠无明显差别，PAPP-A的最佳筛查时间为妊娠10～14周，<0.5MOM应作产前诊断。PAPP-A<0.5MOM也可见于胸腹腔积液、双肾积水、腹水、羊水过多、死胎等；PAPP-A>2.5MOM可见于唇裂、尿道下裂等。

表5 正常妊娠孕妇血清PAPP-A参考值（mIU/ml）

引自：章晓梅，李春华，冯怀英，等.孕妇血清PAPP-A蛋白测定早期筛查染色体病.中国优生与遗传杂志，2001，9（2）：24-38.

注：4-41周孕妇血清PAPP-A浓度曲线，系列1为浓度平均数，系列2为中位数，系列3为0.5倍中位数，系列4为2.5倍中位数。

图5 正常妊娠孕妇血清PAPP-A含量变化趋势

抑制素A（inhibin A） 被认为是一个由合胞体滋养层产生的化学物质，1992年有学者开始研究其与DS胎儿的相关性，研究发现孕妇血清中与DS胎儿相关的主要物质是二聚体抑制素A。Aitken等研究发现，在妊娠7～8周检测二聚体抑制素A，怀DS胎儿的孕妇血清中二聚体抑制素A浓度较正常孕妇的高出2倍。进一步结合AFP、hCG能大大提高DS的检出率，在一些多标记联合筛查中发现其作用不可忽视，甚至超过uE3的趋势。

糖原抗原125（CA-125） 为一种大分子量糖蛋白，其生理功能目前尚有争议。1990年Cherk等报道孕早期孕妇血清中糖原抗原125水平高于正常值，可能与胎儿自发流产和DS有关。1997年Wenstrom等用研究数据统计表明，这一标记在筛查DS胎儿时，其阳性率可达45%，并认为这一标记可用于多标记联合筛查。

三、胎儿神经管缺陷的产前筛查

胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs）是出生缺陷最常见疾病类型之一，其发病是由于受精后20～24天内神经盘折叠过程中神经管不能闭合导致的。多数的神经管缺陷是开放性的，神经组织完全暴露或仅仅盖有一层薄薄的透明膜；只有极少部分损伤是闭合性的，神经组织由皮肤或一层很厚的膜完全覆盖。无脑畸形、脊柱裂、脑膨出是神经管缺陷三种主要类型。

1977年首次报道血清中AFP水平升高和开放性神经管缺陷畸形有关，因为开放性损伤时胎儿体内高浓度的AFP有可能通过胎儿血液循环到达羊水，再通过羊膜渗入母体循环，引起母体血清中的AFP显著升高。因此通过检测孕妇血清中AFP浓度可以进行神经管缺陷的产前筛查，可以检出80～90%的开放性神经管缺陷。在英国，由于开展了神经管缺陷胎儿血清筛查，其神经管缺陷胎儿的出生率从1960年的1/350降至1987年的1/2500,下降了86％。结果说明AFP是一个很有效的神经管缺陷筛查指标（一般>2.5MOM，它在筛查胎儿神经管缺陷中的作用是其它标志物无法替代的）。

四、18-三体综合征的产前筛查

18三体综合征可以用孕妇血清联合筛查，怀有18三体综合征胎儿的孕妇孕中期血清hCG、AFP和uE3水平降低，以AFP≤0.75MOM；hCG≤0.55MOM；uE3≤0.60MOM为切割值，18三体综合征胎儿阳性检出率可达出60～80%。

五、产前筛查血清标志物的联合应用

产前筛查各种不同血清标志物筛查特性见表6。

表6 各种不同血清标志物筛查特性

21三体综合征：妊娠中期母血AFP下降，uE3下降，F-β-hCG上升（三联筛查方法）。PAPP-A和F-β-hCG在妊娠10周左右有较大价值，PAPP-A下降，F-β-hCG上升，检出率达63%，这个组合已成为孕早期筛查最佳组合。有学者认为四联筛查方法（AFP，uE3，F-β-hCG，INHA）的检出率优于三联筛查方法。

神经管缺陷：孕早期母血AFP和F-β-hCG正常，PAPP-A下降；孕中、晚期PAPP-A明显下降，AFP上升。

18三体综合征（Edward综合征）：PAPP-A和F-β-hCG具有孕早期筛查18三体综合征的价值，母血F-β-hCG和PAPP-A下降；孕中期，18三体综合征母血AFP下降，uE3下降，F-β-hCG下降。

13三体综合征（Patau综合征）：血清标志物变化与是否合并神经管缺陷有关。

Turner综合征：妊娠中期uE3下降，AFP改变不明显或增高。如有胎儿非免疫性水肿hCG上升，否则hCG下降。

染色体三倍体：当为69条染色体时，血清标志物变化各不相同，一般认为AFP上升，uE3下降，F-β-hCG或高或低。

死胎：孕早期和孕中、晚期死胎，母血F-β-hCG和PAPP-A均明显下降（胎盘功能破坏），而AFP升高（胎肝合成的AFP溢漏）。

多胎：AFP、uE3、F-β-hCG均升高。

六、产前血清标志物筛查的影响因素

影响血清标志物的因素较多，易造成假阳性或假阴性，需采取措施予以纠正。1．孕周估计误差：妊娠周龄对筛查结果计算十分重要，计算方法有两种：由末次月经（LMP）日期来推算，这种方法对月经周期规律者较好，但对月经周期不规则者不适用。超声波测量胎儿的双顶骨间径(BPD)是较正确的方法。当两种方法计算怀孕天数误差超过10天时，则以BPD为准；不足十天的两法均可。

2. 多胎的影响：双胎或多胎妊娠时，血清生化指标明显高于单胎妊娠。双胎的DS检出率要低于单胎。

3. 孕妇体重：孕妇体重过重由于稀释作用可使AFP、uE3、hCG水平降低。

4. 母亲自身疾病：孕妇患有一些其他疾病时，可影响生化指标。如孕妇为胰岛素依赖性糖尿病时，母血清AFP比正常同孕周孕妇低20%，而uE3和hCG水平升高。

5. 母亲吸烟：孕妇吸烟使AFP升高3%，hCG降低3%，uE3降低23%。

6. 种族差异：不同种族的人群正常值不同，AFP在亚洲及黑人的水平较西班牙人和白种人高，hCG在非裔美国人中较高。因此，不同种族人群应建立自己的正常值

7. IVF与自然妊娠相比，hCG明显升高而AFP明显降低。

七、产前筛查流程

产前筛查流程：（遗传咨询），收集资料，采集血样，检测，风险评估，报告结果，病例追踪，遗传咨询，存档。如图6、图7与图8。

图6 产前筛查流程图

图7唐氏综合征（DS）产前筛查流程图

图8 神经管缺陷（NTD）产前筛查流程图

八、产前筛查时间分辨荧光免疫分析法实验操作常规

1. 时间分辨荧光免疫分析法试剂盒检测原理：目前已应用的有标记抗原与未标记抗原（待测或标准品）竞争结合抗体的竞争法、固相抗原与游离抗原（待测或标准品）竞争结合标记抗体的竞争法和固相双位点夹心法等。应用较多的为固相双位点夹心法，如夹心一步法和夹心两步法。方法简便，可以得到满意的灵敏度和特异性，批间批内变异系数小，精密度高。TR-FIA夹心两步法的检测示意图如图9。

图9 TR-FIA夹心两步法的检测示意图

2. 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程：如图10。

图10 时间分辨荧光免疫分析法实验室检测流程

3. 仪器操作流程与注意事项

仪器操作流程：开机→软件注册→软件登录→软件使用（进入测试模块→选择实验项目→新建测试→板孔测试→拟合分析）→退出软件→关机→填写《仪器操作记录》，具体操作如下：

1. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪(后下方绿色按键)仪器后面电源开关，再按下泰莱-I前面的白色按键启动计算机。

2. 打开半自动时间分辨荧光免疫分析仪右边的测试电源开关(绿色按键)

3. 打开电脑桌面TALENT-I图标，进入软件登录界面.

4. 在登录界面中输入登录编号“1”，再输入登录密码“1”.

5. 在进入半自动时间分辨荧光免疫分析仪软件主界面后，按如下指示操作：

6. 上述操作全部完成后,点击有整个界面右下角的“退出”,即可退出TALENT-I软件.

7. 关闭TALENT-I检测仪电脑主机部分及显示器的电源开关,然后关闭测试电源开关,最后关闭TALENT-I仪器的总电源开关.

8. 填写相关记录。

注意事项：按照上面规定的开机和关机顺序进行开关机，以免损坏设备；进行具体的测量前，保证检测仪部分开机预热30分钟以上；出现故障时可以参考“故障排除”一节的内容进行排除；出现不能解决的问题时，请及时与我公司售后服务部联系。

4. 实验操作与注意事项：以AFP和F-β-hCG为例，见下表7。

1）.资料收集常规

资料收集是最关键基础的一步，直接影响检测结果的分析。完整的资料包括：孕妇姓名、出生日期、联系地址电话、孕周、体重、末次月经日期、月经是否规则、是否吸烟、胰岛素依赖型糖尿病、曾出生先天愚型、双胞胎。还有采样日期，因为绝大部分是采用末次月经来推断孕周的。

影响因素与建议：对于月经不规则的孕妇，为了得到准确的孕周信息，要求其做B超确定孕周。必须要有孕妇的签名，规避潜在的危险。个体差异可能导致漏检。

2）. 血样采集常规

采集时间：孕早期：7-13周；孕中期：14-21周。采集的量：3-5毫升静脉血即可。标本保存：分离血清，4℃可保存5天左右；条件允许-20℃冷冻保存。

影响因素与建议：（1）标本中的hCG随时间延长和温度增高会分解为β亚基和α亚基。由于游离的β亚基在血清中含量非常低，分解出来的β亚基会在很大程度上影响β亚基的检测水平，而对完整的hCG的影响则相对较小。因此用β亚基作为指标有可能增加假阳性率。为此实验室在运输或保存标本时要近量避免温度的升高。有学者研究表明，30℃ 6h或35℃ 2h即可使项目浓度明显提高，血标本应及时分离（采用3000rpm 6min以上或2000rpm 15min），分析时室温较高且标本较多，建议将标本置于泠水浴中。（2）本试剂采用的是一步法，不能采用血浆标本，EDTA、柠檬酸盐等螯合剂会影响铕标记的稳定性，使荧光值偏低。

（3）标本避免反复冻融，会使检测物质活性（效价）降低。对溶血、黄疸、脂血等标本应在报告单上注明，特别含大量脂质、严重黄疸及溶血或加热灭活之标本均可能影响检测结果，可建议重新采血。已稀释的血清不宜存放，稀释样本应先加稀释液，再加样本，避免非特异性吸附。

3）. 试剂准备

（1）微孔反应板：将试剂及所需数量的微孔反应板条平衡至室温（20～25℃）。余下的微孔板条及时置入自封袋密闭并于2～8℃保存。

（2）洗涤液：将40ml浓缩洗液和960ml蒸馏水在干净的容器中混合，作为工作洗涤液备用。蒸馏水敬请用户自备。

（3）标记物工作液：使用前配制，将hAFP或Fβ-hCG标记物与实验缓冲液按体积比1：100加进洁净的一次性容器中并混匀，当次试验用完。

影响因素与建议：（1）免疫反应受温度影响，在一定范围内随温度的提高，反应加快。平衡温度可保证实验反应的均一性。（2）配置试剂采用去离子水或蒸馏水，避免酸、乙醇、螯合剂、氧化消毒剂等物质混入。（3）准确配制洗液，洗液中Tween20浓度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原、抗体解吸附而影响实验测定下限。（4）标记物工作液要在使用前配制，容器洁净，充分混匀，避免水分挥发和污染（避免标记物的挥发造成实验室污染,导致本底过高）。

4）. 加样

准确吸取25µl的hAFP或Fβ-hCG标准品标准品（Std）、待测样本(Unk)，依次加入微孔反应板微孔中。

影响因素与建议：（1）建议每次实验必须做标准曲线，待测样本作复孔检测。标准品复溶后2～8℃可以保存6天；如长期保存请在－20℃存放，并避免反复冻融。（2）试剂要混匀，不可剧烈颠倒。加样枪要定时校准，在万分之一天平上误差<10%。加样枪按钮压至第一档垂直握持，使吸嘴浸入液体，浸入深度:20ul和10ul≤1mm,100ul≤2-3mm，200ul和1000 ul≤2-4mm，5000ul≤3-6mm，10000ul≤5-7mm，避免枪头外残留过多，导致结果偏高。加样要准确一致，不可产生气泡、溅出，移液枪头要一次性使用，避免交叉污染，干吸头预先在血清中反复抽吸三次，保证吸样量准确，吸嘴要伸入反应孔底部1/4-1/3处加样，停靠5s，避免样本在反应孔上部滞留，导致非特异性吸附。使用连续加样枪，按常规速度和程序，重复吸加10次，计算误差率50ulCV＜1.5%，100ulCV＜1.0%，1000ulCV＜0.8%。定期进行定标，超标时予以更换。

5）.加铕标记物

向每孔中加入200µl已配好的标记物工作液，并加贴封片。

影响因素与建议：一定要贴加封片，防止液体挥发和污染（避免标记物的挥发造成实验室污染,导致本底过高）。对于同一批实验，使用同样的标记物，否则影响批内重复性和准确性。接触过标记物的吸头、测量完的板等含标记物的物品要及时清理抛弃。

6）. 孵育

微孔反应板条在室温下，用振荡器缓慢振荡孵育（AFP（1小时），HCG（一个半小时））。

影响因素与建议：（1）振荡器缓慢振荡孵育，缓慢振荡可加快反应，使反应反应完全，但振荡过快容易产生气泡或使液体溅出，影响测定结果。（2）严格讲，试剂与标本间，它们产生的基质效应是不可避免的。所以不可随便更改反应时间，如果反应时间不够，有可能导致样本反应不充分，影响检测下限。不可随便更改反应温度，室内实验温度要保证在±1℃内，否则会影响结果天间的重复性。

7）. 洗板

孵育结束后，小心将封片揭下并弃掉，用洗板机洗涤6次，拍干。

影响因素与建议：（1）不可重复使用封片，避免交叉污染。（2）洗板机洗涤后拍干，保证微孔残留液应≤2µl，避免干扰结果。洗板机要定时消毒、清洁，洗板时要注意观察是否加满洗液，是否洗尽。洗板结束后，不要马上关闭洗板机，使用RINSE命令冲洗管道。保持管道通畅，及时倾倒废液，保证有足够的洗液和蒸馏水，以免出现真空错误。对于同一批实验，请保证置于相同的实验条件下，如同样的洗液。

8）.加增强液

向每孔中加入增强液200µl。

影响因素与建议：取增强液时，请采用中间过渡容器，请使用新吸头。加入过程中应悬空，避免吸头触及小孔内壁或其中的试剂，否则交叉污染，导致严重错误结果。

9）.解离-增强

微孔反应板条于室温下缓慢振荡5分钟后上机检测，在30分钟内完成检测。

影响因素与建议：一定要贴加封片，防止液体挥发和污染（尘土中可能含有的稀土元素会影响试验结果，否则结果可能升高）。

分析仪器不应安置在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15-30℃，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。还必须注意仪器的开关机。

10）.结果分析

影响因素与建议：（1）严格使用TRFIA Fβ-hCG测定程序，及时修改参数和数据处理模式，保证结果的准确可靠。（2）评价实验结果的要素：a） 标准品线性佳，变异系数小；b） 质控品在受控范围内，批内 CV<5%，批间 CV<10% ( 期望值 )。美国CLIA’88能力比对检验分析质量要求：AFP和HCG均为靶值±3SD内；c） 样品值符合正态分布。（3）本试剂采用的是一步法，若待测样本中抗原浓度过高，会出现高浓度后带现象，即“钩状效应”（ hook effect ），此时免疫反应被明显抑制，出现错误的低值，要消除这种干扰，只有对样本进行适当稀释后重新测定。

11）.其他

（1）彻底理解本说明书并严格按规定操作对成功使用本试剂盒很重要。

（2）尽量建立洁净的实验室环境，这对成功使用本试剂盒起到重要作用。

（3）试剂盒中所提供的试剂组份为一配套整体，请不要混用不同批号和使用过期的试剂。对所使用的试剂进行名称、批号、收到日期、使用日期和有效期的登记。

（4）本试剂盒和所有待测样本均可能成为潜在传染源，请按相关生物安全防范措施处理。

（6）本试剂盒启封后需在两周内用完。

（7）实验设备建立检测标定档案。仪器使用前，检测并记录灵敏度，误差率等参数，未达到标准，校准后使用。定期维护保养。实验室仪器应专人保管，定期维护保养，建立使用档案及操作者签名制度。

（8）实验技术人员必须要有较强的责任心和事业心，不断提高自身的业务水平，自觉地保质保量地完成筛查工作任务。