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第３２卷 第４期 中国预防兽医学 报 Ｖｏ１．３２．Ｎｏ．４ ２０１０年 ４月 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉ ｎｅ Ａｐｒ．２０１０ 产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重ＰＣＲ检测方法的建立 李伟杰，赵 耘 ，杜昕波，康 凯，陈 敏 （中国兽医药品监察所，北京１０００８１） 摘 要：为建立快速特异的ＰＣＲ方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌，本研究根据 ＧｅｎＢａｎｋ登录的多杀性巴氏杆菌ＫＭＴ１基因和ｔｏｘＡ毒素基因序列，设计合成了２对特异引物。特异性试验表明 产毒素多杀性巴氏杆菌Ｃ５１－６扩增出了４６０ ｂｐ和１ ８５４ ｂｐ的２条目的片段，而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃 希茵、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性；敏 感性试验表明该ＰＣＲ方法能从含４５０ ＣＦＵ的茵液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致 死试验对该ＰＣＲ方法进行了验证。 关键词：产毒素多杀性巴氏杆菌；双重ＰＣＲ；ＫＭＴ１基因；ｔ ｏｘＡ基因 中图分类号：￥８５２．６１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００８—０５８９（２０１０）０４．０２９８． ０３ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｘｉｇｅｎ ｉｃ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｌ ｏｎｙ ｄｉｐｌ ｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ＬＩ Ｗｅｉ－ｊｉｅ，ＺＨＡＯ Ｙｕｎ ，Ｄｕ Ｘｉｎ＿ｂｏ，ＫＡＮＧ Ｋａｉ，ＣＨＥＮ Ｍｉ ｎ （Ｃｈｉｎａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｄｒｕｇ Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ｂｅｉｉｆｎｇ １０００８ Ｉ，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｄｕｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ ｓｅｔｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｉｆｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒ ｏｍ ｔｈｅ ＫＭＴ１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｏｘＡ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｐａｓ￣ｕｒｅＨａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ ａｎｄ ｎｏｎｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ ａｔ ｔｈｅ ｓＲｍｅ ｔｉｍｅ．Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｉｆｃａｌｌｙ ａｍｐｌｉｆｙ ｂｏｔｈ ４６０ ｂｐ ａｎｄ １ ８５４ ｂｐ ＤＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅｅ ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ Ｃ５ １－６，ｂｕｔ ｎｏｔ ｆｒｏｍ ｎｏｎｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｐ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｅ．ｃｏｌｉ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｓｕｉｓ ａｎｄ Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｆｉｃａ ｓｕｂｓｐ．Ｉｔ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｄｅｔｅｃｔ ａｓ ｌｉＲｌｅ ａｓ ４５０ ＣＦＵ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ ｖｅｒｉｆｉａｂｌｅ ｂｙ Ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｓｋｉｎ ｔｅｓｔ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｌｅｔｈａｌ ｔｅｓｔ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ；ｄｉｐｌｅｘ ＰＣＲ；ＫＭＴ１ ｇｅｎｅ；ｔ ｏｘＡ ｇｅｎｅ 产毒素多杀性巴氏杆菌（Ｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｐａｓｔｅｏｒｅｌｌａ 肤坏死试验、小鼠致死试验、细胞毒性试验操作繁 ｍｕｌｔｏｃｉ ｄａ，Ｔ＋Ｐｍ）是引起猪萎缩性鼻炎、兔巴氏杆菌 琐、费时耗材 ；此外，目前还没有合适的血清学 病和禽霍乱的主要病原菌。该菌分泌产生一种由ｔｏｘＡ 方法［２］。自从发现并测定了产毒素多杀性巴氏杆菌 基因编码约１４６ ｋｕ的皮肤坏死毒素（Ｄｅｒｍ．ｏｎｅｃｒｏｔｉｃ 的毒素基因ｔｏｘＡ序列后，人们开始探索应用ＰＣＲ ｔｏｘｉｎ，ＤＮＴ），该毒素由１ ２８５个氨基酸组成【ｌＪ。 方法来鉴定产毒素多杀性巴氏杆菌。本研究旨在建 目前，由该菌引起疾病的确诊主要依靠对产毒 立快速特异的ＰＣＲ方法，并同时检测并区分产毒素 素多杀性巴氏杆菌进行病原分离和产毒能力的鉴 多杀性巴氏杆菌与不产毒素多杀性巴氏杆菌 定，但其细菌形态观察、生化试验及毒素的豚鼠皮 （Ｎｏｎｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｔ‘ａｍ）。 ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔ ｈｏｒ 收稿日期：２００９—０９—０９ 基金项目：国家科技支撑计划（２ｏ０６ＢＡＤ０６Ａ１１） 作者简介：李伟杰（１９７９一），男，山东莱州人，助理研究员，主要从事兽医微生物资源开发和利用的研究 通信作者：Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈａｏｙｕｎ＠ｉｖｄｃ．ｇｏｖ． ｃｎ
第４期 李伟杰，等．产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重ＰＣＲ检测方法的建立 １ 材料和方法 １．１ 菌 株 产毒素多杀性巴氏杆菌Ｃ５１－６（Ｄ 型）、不产毒素多杀性巴氏杆菌Ｋｏｂｅｒ．６（Ｄ型）、参 考菌株大肠埃希菌ＣＶＣＣ２４４、胸膜肺炎放线杆菌 ＣＶＣＣ２６６、链球菌ＣＶＣＣ６０６、支气管败血波氏杆菌 ＣＶＣＣ２９９９、副猪嗜血杆菌ｈｕａｌ２０和鸡白痢沙门菌 ＣＶＣＣ７９２０１由中国兽医药品监察所菌种室保藏。 １．２ 菌株的培养 多杀性巴氏杆菌用马丁汤溶解 后，接种改良马丁琼脂斜面（含４％马血清和０．１％ 血红素），３７℃培养过夜；支气管败血波氏杆菌用 马丁汤溶解后接种Ｂｏｒｄｅｔ—Ｇｅｎｇｏｕ琼脂斜面，３７℃培 养过夜；链球菌用马丁汤溶解后，接种血琼脂斜 面，３７℃培养过夜；大肠埃希菌和鸡白痢沙门氏菌 用普通肉汤溶解后接种普通琼脂斜面，３７℃培养过 夜；副猪嗜血杆菌和胸膜肺炎放线杆菌用ＴＳＢ（含８％ 小牛血清和０．０２％ＮＡＤ）溶解后接种ＴＳＡ（含８％小 牛血清和０．０２％ＮＡＤ）斜面，８０ ｍＬ／Ｌ ＣＯ 环境中 ３７℃过夜培养。取各菌种的斜面培养物划线接种相 应的平板，３７℃培养２４ ｈ，单菌落直接作为ＰＣＲ 反应的模板。 １．３ 主要试剂Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（５ ｕ／ Ｌ）、１０× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（含２５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＭｇＣｌｚ）、ｄＮＴＰ（２．５ ｐ