一、microRNA简介

1．什么是microRNA

microRNAs（microRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约19~23个核苷酸。成熟的microRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。最近的研究表明microRNA参与各种各样的调节途径，包括生物个体发育、病毒防御、组织分化、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、参与原癌基因作用等等。

2. MicroRNA的发现

1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA（lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3'UTR区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。7年后科学家又发现了第二个microRNA－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。

自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了上千个的microRNAs。被鉴定的microRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。此网站由著名的Sanger研究所主办，并对公众开放。（http://www.mirbase.org/）

3. microRNA的产生与作用机制

microRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，约60%microRNA单独表达，15%的microRNA一基因簇的形式表达，而25%的microRNA位于基因的内含子中，与基因同时被转录。

microRNA通常来源于一个大小约1000bp的长链RNA初始转录产物（Pri-microRNA），Pri-microRNA分子在细胞核中经过双链RNA特记性RNaseIII-Drosha的作用形成70-100nt的具有茎环结构的RNA分子（Pre-microRNA）。Pre-microRNA在exportin-5的作用下转运至细胞质中，被另一个双链RNA特异性RNaseIII-Dicer识别，被进一步切割成19-23nt的小分子RNA，即成熟的microRNA，microRNA再被PPD（PAZ&Piwidomain）蛋白质家族成员识别并结合，类似RNA干扰过程形成RNA/蛋白质复合体—RISC（见下图）。在动物细胞中，单线microRNA通过序列完全或不完全的匹配互补到mRNA上，从而抑制mRNA的翻译。

但是microRNA抑制mRNA翻译的机理还不清楚，目前发现的机理有：miNRA翻译起始抑制机制；microRNA翻译起始后抑制；microRNA介导的mRNA衰减；microRNA的正调控和去抑制等等，具体机理还有待我们科研工作者进一步研究和探讨。

4. MicroRNA与siRNA的异同

siRNA是RNAi途径的主要作用物，microRNA和siRNA很容易混淆，他们有许多共同点也有许多不同点。

microRNA和siRNA都是由22个左右的核苷酸组成，都依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。二者生成都需要Argonaute家族蛋白存在，而且都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如在介导沉默机制上有重叠。另外，它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译。

microRNA和siRNA本质上的区别就是microRNA是内源的，在基因组中有固定的基因座位，70％～90％位于蛋白基因的基因间隔区，其余在内含子，还有个别在编码区的互补链；siRNA可以是人工体外合成的，也可以是基因组的转录片断，降解片断，和转座片断，病毒基因组转录片断等，关键在于siRNA没有固定的基因座位，本身不是基因组的功能片断，是随机产生的，即加工位点不是保守的。结构上，microRNA是单链RNA，而siRNA是双链RNA。3.Dicer酶对二者的加工过程不同，microRNA是不对称加工，microRNA仅是剪切pre-microRNA的一个侧臂，其他部分降解；而siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂。在作用位置与作用方式上，microRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解，即在转录水平后和翻译水平起作用，主要在发育过程中起作用，调节内源基因表达。而siRNA可作用于mRNA的任何部位，但siRNA只能导致靶标基因的降解，即为转录水平后调控，原始作用是抑制转座子活性和病毒感染。

二、microRNA的研究思路与方法

对microRNA的深入研究具有重大的生物学意义，不仅有利于我们对生物体生理、病理机制的理解，还能为疾病的诊断和治疗中提供理论依据。

已有研究表明,microRNA在发育、细胞增殖、凋亡、脂类代谢、激素分泌及肿瘤发生等多种生理和病理过程中发挥重要作用。针对microRNA的研究方法主要包括两大类:一是以传统实验技术方法为基础建立起来的microRNA特有的技术方法,二是已成熟应用的生物信息学技术。前者侧重于microRNA表达的检测和功能机制的阐明,后者则包括新microRNA基因及microRNA靶基因的预测。两者相辅相成,互为补充,为深入地研究这类分子的功能和分子机制提供了大量功能线索及确凿的实验证据。

由于microRNA序列短、没有poly(A)尾巴、在细胞内的表达水平比较低，而且许多同源microRNA（如let-7家族）序列相似度高，仅差1-2个碱基，使设计的分析探针与杂交的效率低。这些特性给microRNA定量检测方法的建立带来了困难和挑战。

为了提高杂交反应的亲合性和检测灵敏度，丹麦Exiqon公司的锁核酸（Locked Nucleic Acid， LNA）技术被应用于microRNA的分析研究。LNA是一种双环结构的核酸类似物，这种特殊的双环状核苷酸衍生物结构中含有一个或多个2’-O，4’-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2’-O位和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性，实验表明，在寡核苷酸探针中每引入1个LNA修饰碱基，其与相应的DNA杂交时，解链温度会提高1-8℃，而在与RNA杂交时解链温度会提高2-10℃，从而提高LNA探针与microRNA分子的杂交特异性和灵敏度。

由于LNA与RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，LNA有很多优点：和RNA互补的双链有很强的热稳定性、实现探针高灵敏度；水溶性好，自由穿入细胞膜，易被机体吸收；体内无毒性作用；高效的自动寡聚化作用，合成方法相对简单，部分或完全修饰的LNA寡核酸链可用氨基磷酸法在DNA自动合成仪上合成。LNA探针与核酸杂交具有严格序列特异性，能有效区分碱基错配从而实现高特异性。

目前，基于锁核酸（LNA）等技术的支撑，科学家研究出了多种有效的microRNA检测方法，如Northernblotting、微阵列法（microRNAarray)、克隆和测序法、实时荧光定量PCR法等。

1. Northern印迹

从microRNA的发现到现在microRNA的研究，Northern印迹技术一直被应用microRNA的鉴定和新microRNA的发现。该方法一般是先用聚丙烯酰胺电泳（PAGE）分离出总RNA中长度约200bp以内的小RNA，然后转移至印迹膜上与标记的寡核苷酸探针进行杂交。探针杂交，经洗膜、显影后对条带进行分析，标记探针有放射性同位素标记和生物素或地高辛等非同位素标记。

虽然Northern印迹是当前microRNA分析的标准方法，但其缺点是操作繁琐、耗时长、灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，且对RNase污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。

锁核酸(LNA)修饰的杂交探针取代传统DNA探针的技术，使Northernblotting法的检测灵敏度和特异性得到显著改善。LNA（寡核苷酸衍生物）具有高亲和性，可掺入到DNA中的任何位置,含有LNA的探针与靶分子结合后的双链热稳定性提高，方法灵敏度比普通Northern印迹法高10倍，特异性也明显提高。

2.表达谱

由于microRNAs在众多程序的调控，诸如生物发育、细胞增殖和凋亡以及近来被证明与肿瘤发生相关等领域发挥作用，因此microRNAs的鉴定和定性研究成为迅速发展的一大研究领域。最典型的鉴定microRNAs的方法是检测microRNA的表达谱，如果发现某一种microRNA在某种特定组织或细胞中特异性表达的话，此microRNA将被假定在此特定组织或细胞中发挥某种调控作用。同样，如果某一种microRNA在生物特殊发育阶段表达的话，则它有可能是调控发育进程一个主要分子。

㈠ 微阵列芯片技术(Microarray)

microRNA的表达谱可以通过克隆特定组织、细胞或者某个生物体特定发育阶段的microRNA并测序完成，或者通过芯片检测得以完成。微阵列芯片技术(Microarray)是一种高通量的检测方法，能够同时测定多个样本,可以实现microRNA的高通量分析,即在一块芯片上同时固定多个与microRNA序列互补的探针,然后加入经过标记的样本RNA,杂交后进行信号检测。目前，用的最广泛的是基于LNA技术的芯片技术，LNA探针与普通DNA捕获探针相比，可提升熔解温度，自由设计Tm值，使得芯片上的所有探针Tm值均一化，所有microRNA杂交温度一致，保证对所有靶点具有相同的亲和活性。杂交温度高（60度）避免非特异结合，标记无序列偏向性，效率高，无需富集microRNA，因而在灵敏度方面，LNA芯片可以检测常规DNA探针无法检测到的极其微量的microRNA。

至今，很多研究应用该技术建立了不同物种不同组织中microRNA的表达谱，亦有研究比较了正常组织和和疾病组织中microRNA表达谱的差异。Liu等用芯片技术检测了microRNA在不同肿瘤细胞中的表达谱，均经Northern杂交、qPCR证实。Calin等用该技术比较了哺乳动物中B细胞淋巴瘤和正常组织中microRNA的表达谱，为microRNA在肿瘤临床诊治中的应用提出了新思路。Murakami等用该技术比较肝癌组织和邻近非肿瘤组织microRNAs表达谱，发现miR 18和miR 224在肝癌组织中的表达明显上调，而miR 199a、miR 195a、miR 200a和miR 125a在肝癌组织中的表达明显下降。在芯片的基础上，目前已能在特定的细胞中同时检测所有microRNA的表达谱，并且能够检测出福尔马林固定、石蜡包埋组织中的microRNA表达谱，使分析保存标本中的microRNA表达谱成为可能。这也使得microRNA表达谱特征库建立成为可能。某些特定的microRNAs表达差异已经被证明可以用于精确的预测病人的预后。从治疗的角度，microRNA表达谱可能为临床上确定一个治疗方案提供一个强有力的工具。例如，Lu等发现，microRNA特征可以成功地对于组织学上难以诊断的癌症样品进行分类。

microRNA芯片实验主要步骤是选择芯片（或者定制，自制），样品RNA提取，标记和杂交，结果扫描和分析。

⑴选择芯片

定制芯片的选择更多取决于探针设计，是microRNA芯片分析的一个关键。由于microRNA本身长度的原因，成熟microRNA长度不超过22个核苷酸，因此不可能随着熔解温度（Tm）调整探针序列，利用LNA（lockednucleicacid）技术可以使熔解温度升高，而且LNA与核酸杂交有严格的序列特异性，比普通寡核苷酸更有效地区分碱基错配。

⑵RNA提取

⑶标记和清洗

microRNA表达谱分析是一种对所有已知microRNAs的表达模式进行研究的方法，不同的microRNA标记方法会直接影响芯片表达谱精确性，因此要选择合适的microRNA标记系统。

由于microRNAs小分子的限制，标记的方法相应的收到了限制，较为常用的标记方法是酶法和化学法。前者主要基于poly(A)聚合酶I，在纯化后的microRNAs的3’端上加上多个氨基染料修饰的核苷酸。后者则是将荧光标记直接通过共价作用加在microRNA分子上。

⑷杂交

杂交反应的过程与一般的分子杂交过程基本相同，杂交反应的条件要根据探针的长度、GC碱基含量及芯片的类型来优化，如用于基因表达检测，杂交的严格性较低，而用于突变检测的芯片的杂交温度高，杂交时间短，条件相对严格。杂交完成后，后续的数据分析可以根据选择的芯片所提供的数据库进行分析。

microRNA芯片技术缺点：尽管基因芯片技术敏感度有了很大提高，且可用于多个microRNA同时检测，但仍有不足：；①是不适用于新microRNA的发现鉴定，此类研究可能需要用到一些新技术，比如microRNA研究奠基人新开发的True单分子测序技术（TrueSingleMoleculeSequencing），以及约翰霍普金斯大学等发现了新型分析技术：miRAGE等。②芯片上不同的探针分子和待测分子之间容易发生交叉反应,使得测定结果准确度低、重复性差和假阳性高。③芯片上探针与待测样本的杂交效率也不高。④基因芯片的制作和检测需要昂贵的仪器设备。⑤且芯片筛选得到的结果仍需要QPCR验证，筛选周期长和实验较为繁琐。

㈡实时荧光定量PCR芯片系统（microRNA PCR ）

基于探针杂交技术的microRNAarray技术上述的缺点，应用范围受到限制，如能采用现有的DNA扩增技术，则可以极大地提到microRNA的检测灵敏度。与常规的microRNA表达谱芯片不同，实时荧光定量PCR芯片系统更加的简单方便，不需标记、操作简单、成本较低、并且灵敏度极高；能在短时间内获得结果，可同时检测多个microRNAs表达，且需要的RNA量较少，因而被广泛用于组织中microRNA表达谱的构建。

但是与mRNA不同，成熟的microRNA分子很短（18-25nt），没有poly（A)尾巴，无法按常规方法设计随机引物进行反转录和ＰＣＲ扩增。经过科学家不懈的努力，近年来发展了多种扩增microRNA的方法，如PCR扩增法，滚环扩增法（RCA),引物入侵法（Invader）和克隆法等。对microRNA扩增产物的检测方法与常规mRNA扩增产物的检测方法基本一致，主要有SYBRGreen(SG)荧光染料法，TaqMan探针法等。其中应用最广泛的是实时荧光定量PCR法（qPCR）。

miRCURY LNA™ Universal RT microRNA PCR Panel原理主要是通过大规模的将设计并验证过的microRNA特异性引物于96孔板或384孔板中，通过将逆转录microRNA得到的cDNA加入到每个孔板中进行qPCR来实现microRNA高通量分析。该技术的优势在于凭借高的PCR扩增效率，将PCR的高灵敏度和高特异性引入microRNA检测中。关于qPCR的原理将在microRNA定量中详细介绍。(放置Panel筛选示意图)

2.3定量（Real-time PCR）

当用表达谱技术进行了高通量筛选之后，则需要精确检测筛选出的microRNA表达水平，Real-time PCR是精确定量的检测microRNA的方法之一，基于成熟的microRNA分子很短（18-25nt），没有poly（A)尾巴的情况，目前采用qPCR技术对microRNA进行定量检测的方法主要有三种：

⑴PE-qPCR

该法是在常规引物延伸技术（PE）的基础上建立的引物延伸定量PCR法（PE-qPCR）。即先通过一个加尾的microRNA特异性引物（GSP）将microRNA反转录成加尾cDNA，然后利用一个LNA修饰的microRNA特异性反向引物（RP）和一个与加尾序列一致的通用引物（UP）进行PCR扩增；

⑵加尾法

先用Poly（A)聚合酶（PAP）处理总RNA，使microRNA的3端加上一段poly（A)尾巴，然后用5端含有接头序列的poly（T)引物进行反转录，使第一链cDNA加上一段接头，为随后的PCR扩增提供反向通用引物序列，再利用一条与microRNA序列特异的LNA修饰的正向引物就可实现ＰＣＲ扩增。

⑶茎环法（stem-loop）

利用茎－环状引物逆转录microRNA，称为stem-loopRT-qPCR检测法，茎-环反转录引物中除含有一段与microRNA互补的特异性序列外，还含有一段较长的共有序列，与靶microRNA退火反转录后，能得到一个较长的反转录扩增子（cDNA），共有序列提供了一个通用引物结合位点，然后通过一个与microRNA序列特异的引物和一个通用引物进行PCR扩增。

以上的qPCR法采用的信号检测模式主要有两种：SYBR Green荧光染料掺入法和TaqMan探针法。前者成本低，基于目前常用的LNA技术，可以区分一个碱基差异的microRNA。而且使用SYBR Green染料进行信号检测检测后，可以通过融解曲线分析PCR扩增的特异性，可以避免出现的非特异性扩增的假阳性结果。后者成本相对较高，特异性也不错，但每种microRNA都需要设计一个特异的反转录引物，若需要对样本中多个microRNA的定量，其从反转录到定量PCR，工作量较大。虽说microRNA的上游定量引物和探针是特异的，但下游引物仍然是通用的，且不能用融解曲线分析特异性，因此可能会引起过度扩增或形成引物二聚体。

2.4原位杂交

原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等(1969)首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。

RNA原位核酸杂交又称RNA原位杂交组织化学或RNA原位杂交。该技术是指运用cRNA或寡核苷酸等探针检测细胞和组织内RNA表达的一种原位杂交技术。其基本原理是：在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合(杂交)，所形成的杂交体(Hybrids)经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。RNA原位杂交技术经不断改进，其应用的领域已远超出DNA原位杂交技术。尤其在基因分析和诊断方面能作定性、定位和定量分析，已成为最有效的分子病理学技术，同时在分析低丰度和罕见的mRNA表达方面已展示了分子生物学的一重要方向。

近年来，该技术还扩展到对细胞水平microRNA的检测，80年代后期可在福尔马林固定、石蜡包埋的组织中进行原位杂交，现已扩展到细胞及亚细胞水平进行microRNA的检测。该技术不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的microRNA表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中microRNA的表达水平。该方法更直观地展现了microRNA的空间表达模式。

之所以有如此突飞猛进的进步，主要是依赖于针对microRNA序列短的特性，对传统的检测microRNA表达的原位杂交技术进行了大量的改进，目前应用最广的是将LNA探针应用于microRNA原位杂交分析。Wienholds等已应用LNA探针在斑马鱼中检测了数百个microRNAs的空间表达模式。随后，Kloosterman等对该技术的杂交条件等进行了优化，在鼠胚中检测了15种microRNAs的空间表达模式，使其成为研究microRNA空间表达特性的最有力工具。Darnell等利用LNA探针在早期发育的级配重高通量检测了135个microRNAs的表达。目前，ISH数据库中收录了数百个利用LNA探针检测的microRNAs在鸡胚早期发育中的空间表达模式。

其主要缺点是技术掌握比较困难，试验周期长。

2.5 功能实验

自首个microRNA的发现到第二个microRNA的发现，用了7年的时间，而2000年至今已有多达8600余个microRNA在不同物种体内被发现，目前，miRBase已经记录了人类microRNA（has-microRNA）及其亚型1200多个，在不断发现新microRNA的同时，人们也开始了对其功能的探讨。通过microRNA功能研究，能够确定特定microRNA的目标和作用，分析单个microRNA失调的生物学意义。

目前主要通过两种策略进行microRNA的功能研究：正向遗传学策略，即从具有突变表型的生物体中寻找引起该形态生理变化的microRNA基因，从而进一步确定该microRNA分子所起到的确切作用；反向遗传学策略，即首先要运用生物信息学的手段分析microRNA的可能作用靶基因，然后构建待研究microRNA的表达载体或者合成其反义寡核苷酸，通过合适的转染手段，使其导入细胞或生物体，以达到对已知的microRNA进行过表达或反义抑制的效果，即上调某个microRNA获得Gain-of-function表型或下调某个microRNA获得Loss-of-function表型。观察由此而产生的对细胞生物表型以及生化功能方面的影响，进而确定其生物学功能。随着生物信息学的发展，反向遗传学方法已经成为现阶段研究哺乳动物microRNA分子功能的主要方法。

对于microRNA基因沉默的方法主要包括Knockdown和Knockout，目前大多数是基于Knockdown技术的下调或抑制，比如Morpholinos寡核苷酸，2-O-methyl寡核苷酸，LNA修饰的核苷酸等反义核酸技术。在in vivo方面，为多篇文献引用的基于体内的LNA修饰的knockdown inhibitor拥有硫代磷酸酯骨架修饰，可降低核酸酶的进攻和降解；50%以上的LNA修饰，更强的抑制效果；CpG甲基化避免引起免疫应答。而microRNA的Knockout技术从2007才开始首次应用到小鼠方面，进行体内的功能分析和靶基因鉴定。

对于microRNA过表达实验，in vivo的研究方法主要是转基因过表达技术，包括转基因斑马鱼，转基因鼠等。In vitro的研究方法主要是转染化学合成的microRNA和表达microRNA的表达载体（病毒载体和普通表达载体）两种方法。基于病毒的miRNA过表达可以实现microRNA长期和稳定的过表达。化学合成的microRNA包括前体和成熟体的双链。

Pre-miR microRNA Precursor Molecules是与细胞内特定的microRNA前体结构接近的，但经化学修饰和优化的核苷酸分子。其能模拟体内microRNA自然的剪切过程，经过加工成为microRNA成熟体，它能直接进入内源microRNA调节途径从而上调特定的microRNA分子。具有直接高效和剂量容易控制等特性。

Morpholinos反义寡核苷酸广泛应用于斑马鱼中的的基因knockdown研究。Morpholinos是经过吗啉代环的修饰使它更稳定它与靶序列结合后通过空间位阻效应发挥作用，更加稳定高效，可针对mRNA的5UTR或ATG附近的编码区来阻止蛋白翻译，也可以针对mRNA前体的剪切微点来阻止正确剪切。但它有时会出现发育延迟和广泛性细胞凋亡等非特异现象。

在确定了靶mRNA之后，找到位于3ˊ-UTR区的microRNA结合位点是研究者下一步关心的内容。microRNA靶标鉴定常采用报告基因检验试验的手段，该实验的原理是将待分析的microRNA的3ˊ-UTR区克隆到报告基因如荧光素酶（luciferase,luc),(Green Fluorescent Protein,GFP)，增强型绿色荧光蛋白（Enhanced GFP）或Ctx（cytotoxic sensor）（细胞毒性感应基因）等基因后，改变microRNA的表达程度，并检测荧光的强弱或细胞存活变化，从而对3ˊ-UTR是否为靶标进行判断。报告基因检验实验的针对性强，置信度高，常被用作microRNA靶标鉴定的判断性试验。

综上，microRNA检测技术经历了从相对定量到定量，从低敏感度、特异度到较高敏感度、特异度的发展过程，有了很大的改进，但都存在有待完善之处。相信随着检测技术的进一步改进，对microRNA的研究也会不断取得进展。

三．microRNA研究进展

3.1 microRNA调节生物体发育

microRNA通过转录后水平调控蛋白质的合成参与各种生命过程。Wienholds等报道microRNA在斑马鱼胚胎发育过程中呈现空间性和时序性的动态表达模式。近年来关于microRNA与组织器官形成的报道不断出现，包括心脏，血管，肌肉，肺，肾脏，皮肤，牙齿，脑，造血系统等。

Yang等对Dicer基因突变小鼠研究揭示了microRNA在胚胎血管形成中的重要作用。Suarez等科学家观察发现内皮细胞Dicer基因特异剔除的小鼠对形成血管的刺激反应降低，为内皮microRNA影响血管生成提供了体内研究证据。Wang等发现内皮细胞特异性miR-126调节血管发生和发育，靶向删除miR-126基因的小鼠血管完整性缺失，内皮细胞功能发生缺陷，进而导致血管渗漏，出血，甚至胚胎期死亡。

3.1.1 m iRNA 调节细胞的早期发育

Tang等通过实时定量PCR方法比较鼠未成熟卵子、成熟卵子、合子microRNA表达谱,结果显示,未成熟卵子在逐渐发育成熟过程中microRNA的表达呈现动态变化, 但检测可见成熟卵子与合子的 microRNA表达谱基本一致,而随着合子发育由单细胞分裂增殖形成2细胞胚时,microRNA 不断被降解导致其总量下降达 60% ;在 2细胞发育到 4细胞期时, microRNA 的表达又开始上调, 其中 m iR-290簇上调达 15倍。比较正常小鼠与 Dicer突变体鼠的成熟卵子基因表达谱可见, 部分母源性的基因表达受胞内 microRNA 分子的直接或间接调控, 从而表明母源性来源的 microRNA 分子对小鼠早期的胚胎发育是必需的。

3. 1. 2 microRNA参与细胞分化和组织发育

Tay等研究结果发现，小鼠胚胎干细胞在视黄酸诱导下下第4天高表达miR-134,在N2B27诱导下第2天高表达miR-134。单独上调miR-134的表达,可以促进小鼠胚胎干细胞向外胚层分化,且这一作用可被miR-134的抑制剂阻断。在肌肉发育方面,Clop等证实，Texel绵羊中的GDF8基因的3UTR内的一个点突变产生了可以在骨骼肌内高度表达的两个microRNA,即miR-l和miR-206,它们同时作用的靶位点,从而引起microRNA介导的myostatin浓度在转录后降低而造成肌肉肥大。

3.1.3 m iRNA参与调节基因的表达

在各类小分子RNA中，microRNA具有最广泛的基因调节功能。在培养的人293T细胞试验中发现microRNA和siRNA可能通过相似的机制抑制mRNA的表达。内源性人的miR-21通过与靶位完全互补诱导mRNA剪切,这种特性一度被认为是siRNA的特性之一。相反,将合成的siRNA通过与位点错配可以下调mRNA的表达,而最终选择哪几种机制也许在很大程度上完全取决于其与靶没ＲＮＡ的互补程度。

3.2microRNA与疾病

microRNA与多种疾病的发生，发展密切相关，已经有关于与心脏病，肌营养不良，糖尿病，肝炎，恶性肿瘤，帕金森病，唐氏综合症等疾病相关的研究证据。2002年，microRNA与肿瘤的关系首次在慢性淋巴细胞白血病中报道，此后microRNA在人类恶性肿瘤中的异常表达成为今年来的研究热点之一。

最初表明microRNAs在人类疾病中发挥重要作用的数据来自于癌细胞的microRNA功能研究。几个因素促成了在这一病理背景下早期评估microRNA的重要性。首先，20世纪90年代初科学家们最早发现的microRNA是线虫中的lin-4和let-7，当它们丧失功能时，诱发了肿瘤生物学的某些方面。在lin-4和let-7突变体中，特定的干细胞谱系无法在幼虫的适当阶段发生分化，维持了早期阶段的分裂特性，并在进入成虫阶段后继续发生细胞分裂。随后，研究人员在果蝇中发现了调控细胞增殖和凋亡的microRNAs，进一步确定了这些调控RNAs与癌症相关信号通路之间的关联。同时Croce和同事们开展的一项开创新研究表明在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中miR-15a/16-1簇频繁缺失，表明这些microRNAs充当了肿瘤抑制因子。这些研究发现随后引发了近10年癌症中microRNAs功能的集中性研究。

现在基于成百上千的表达分析研究，科学家们已清楚地知道相对于正常组织，肿瘤普遍地显示了microRNA表达模式失控。microRNA表达模式为肿瘤分类和预测提供了有用的信息。然而，由于microRNA在许多情况下呈高度细胞类型特异性表达，对这些分析研究的结果还必须慎重地解析，因为在癌细胞中microRNAs的明显失调有可能只是反映了相比于正常组织，肿瘤中存在多种不同的细胞群。这一告诫强调了开展严密的功能试验直接评估microRNA功能获得与丧失对肿瘤细胞行为影响的至关重要性。现在大量这样的试验在人类癌细胞系、遗传工程小鼠中和多种情况下开展，证实microRNA的活性显著地影响了肿瘤发生发展。例如，在小鼠中转基因表达miR-155或miR-21就可以触发淋巴瘤形成。相同的，在小鼠造血祖细胞中表达miR-17-92簇可以加速Myc诱导的B细胞淋巴瘤形成，体外敲除这一microRNA位点则可诱导Myc驱动的淋巴瘤细胞凋亡。与此相反，系统导入选择性microRNAs包括let-7、miR-26a、miR-34a和miR-143/145则可以抑制体内的肿瘤进展。再加上表明不同类型肿瘤中这些microRNAs存在调节失控的表达研究数据，将这些microRNA基因与癌细胞中循环扩增或敲除连接到了一起的基因组数据，可以确信是特异的microRNAs可以充当原癌基因和肿瘤抑制因子。

癌细胞中microRNA功能获得和丧失的巨大效应与在线虫和小鼠中敲除microRNA研究结果相比差别显而易见。如上所述，很少会在无压力的动物中出现明显的表型。此外，在许多情况下，传导抗癌microRNAs似乎只选择性地影响了肿瘤细胞生长和生存，而正常的细胞则不受这些效应的影响。这些研究结果表明瘤性转化代表了一种对microRNA介导活性敏感性增强的状态。那么为什么癌症环境内microRNA失调的表型效应会如此强大，microRNAs在癌细胞中的活性与在非转化细胞中的活性有什么差别？一种简单的解释认为microRNA介导的调控表型效应在压力情况下获得了增强。

3.3生物标志物-microRNA

microRNA调控人类的生长发育，生理，病理状态。体液中广泛存在的microRNA可能成为人类生理和疾病转台的新的有效的生物标志物。正常组织和病理组织中microRNA表达水平存在差异，即使是同一组织不同分化时期，microRNA水平也不相同。这种差异表达也发生在肿瘤特异性microRNA上，从而帮助诊断肿瘤的组织来源和特定的肿瘤分型。越来越多的证据支持microRNA作为人类肿瘤的生物标志物。Mitchell等研究发现，检测血清miR-141水平可区分前列腺癌患者与正常人。Ueda等分析了160对胃癌和正常粘液样本，发现胃癌病例中22个microRNA升高，13个降低，292例样本都可以由microRNA的差异表达精确区分。microRNA不仅可以作为诊断标志物，一些microRNA表达水平还与肿瘤预后密切相关。

3.4microRNA与干细胞自我更新调控

自我更新时干细胞的一个重要特征，从这个层面来说，干细胞与肿瘤细胞一样都可以持续分裂。因此如何调节恰当的细胞分裂，使其不会因为太少导致组织发生缺陷，又不至于过分增值恶化为肿瘤，是干细胞生物研究的一个攸关问题。

在多能胚胎干细胞中，有特殊的microRNA的簇集表达，这些microRNA明显区别于分化之后的胚胎和成体，暗示这些microRNA对于干细胞的自我更新具有一定的作用。决定细胞继续增值还是停止分裂或分化。

有研究者通过使用果蝇胚胎作为模型系统，证明了microRNA-1有助于早期胚胎阶段的心脏祖细胞（即干细胞）的决定。microRNA-1有助于维护末期胚胎阶段中的心脏前体，可以调节心脏细胞的分化机制。这都说明microRNAs调控了干细胞的自我更新。

虽然对microRNA的研究取得了很大的进展，特别是microRNA在细胞分化，组织发育，基因调节与疾病调控中的作用，但是目前对microRNA的研究仍属于初始阶段，不少基因还未被发现，已发现的大多数基因和功能和作用机制还不清楚，这极大地限制了microRNA与靶之间对应关系的确认，使得现有的研究报道中可能存在假阳性结果。虽然通过缺失或过表达研究某些microRNA的功能，但对它们如何实现时空特异表达以及如何协同调控靶microRNA仍然知之甚少。因此目前主要工作仍是不断发现新的microRNA并弄清其功能和作用机制，相信随着研究的渗入和分子生物学技术的发展，microRNA在基因调控中的功能和作用机制将给人类带来更多的福音！