丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（PCR-荧光法）

说明书

【产品名称】

通用名：丙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒（PCR-荧光法）

英文名：PCR-Fluorescence Detection Kit for Hepatitis C Virus RNA

汉语拼音：Bingxing Ganyan Bingdu Hesuan Dingliang Ceding Shijihe （PCR -Yingguang fa）

【包装规格】 32人份/盒

【预期用途】本试剂盒用于丙型肝炎的辅助诊断及疗程监控。

【原理和应用】

本试剂盒利用一对丙型肝炎病毒（HCV）的特异性引物，一条特异性荧光探针，采用逆转录酶、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种单体核苷酸（dNTPs）等成分，并应用RT-PCR技术实现对HCV RNA保守基因的扩增，同时通过外标的方法实现对血清或血浆中的丙型肝炎病毒进行定量检测。

本试剂盒可作为丙型肝炎的辅助诊断及疗程监控。

【试剂盒组成】

* 定量校准品具体的参数根据批号不同而不同。详见试剂盒内给定值。

【储存条件及有效期】

裂解液为黄色液体，保存于4℃；

其他试剂目测为透明液体，保存于-20℃，不宜反复冻融，使用前应在室温下完

全融化，并充分振荡混匀后稍事离心；

所有试剂应避光保存；

有效期十二个月。

【自备物品】

1. 自备试剂（分析纯）

氯仿、异丙醇（-20℃预冷）、75%乙醇（用不含Rnase和Dnase的水配制，-20℃预冷）

2. 自备仪器

高速台式冷冻离心机、移液枪、一次性耗材（无酶吸头、离心管、手套、帽子等）、专用工作服、工作鞋、办公用品等。

【适用仪器】

PE-5700，PE-7000，PE-7300，PE-7700，Icycler定量荧光PCR仪

【样本要求】

1. 样本种类：血清或血浆

血清以新鲜采集分离为好，采血6小时内必须分离、收集血清，并将血清转移至一次性使用无RNA酶的无菌微量离心管中。

血浆不能用肝素作抗凝剂。

2. 样本储存：待测样本在2-8℃保存不应超过24hr，-20℃保存不应超过三个月，

-70℃以下可长期保存。

3. 避免反复冻融（最多冻融三次）。

4. 样本运输：在冷冻状态下运输。

【使用方法】

1. 样本处理（样本处理区）

取n个1.5ml无RNA酶的离心管（n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照

+1管阴性对照），作好标记。

在上述每一管中加入待测样本血清、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照各100ul，

然后再各加入300ul裂解液，尽快用吸头反复吸打或轻微振荡混匀（每样本换用一个吸头），再加入100ul氯仿，振荡混匀5sec或颠倒混匀15次（以无肉眼可见的白色块状沉淀为准；注意不宜过于强烈，避免产生乳化层影响分层）。

13000rpm离心10min（注意固定离心管方向，有条件的可在4℃离心，下同）。

取与步骤1相同数量的离心管，各加入200ul异丙醇（-20℃预冷），作好标记。吸

取步骤3各管中的上清转移至相应的管中（在尽量吸尽上清的同时注意不要吸取中间层），颠倒混匀。

13000rpm离心10min（注意固定离心管方向）。

轻轻倒去上清或用吸头吸干液体，加入500ul75%乙醇，颠倒洗涤。

13000rpm离心5min（注意固定离心管方向），轻轻倒去上清或用吸头吸干液体。

7500rpm离心5sec（注意固定离心管方向），用吸头尽量吸干被甩至管底的残余液

体（一份样本换一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀的一面），室温干燥1-5min（干燥时间随残余液体的吸干程度而不同，以沉淀表面无肉眼可见水珠为准；不宜过分干燥，以免RNA不溶）。

各加入10ulDEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，稍微离心，冰上保存备用

（请在2小时内用于PCR扩增），暂时不用时保存于-20℃，时间不应超过3天。

2. 扩增试剂准备（PCR前准备期）

从试剂盒中取出RT-PCR主反应液、酶混合液和荧光探针，在室温下融化并振荡混匀简短离心。

每个测试反应体系配制如下：

计算好各试剂使用量，加入一适当体积离心管中，充分混匀，简短离心，向设定的n个（n=样本数+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+1管阴性对照+4个校准品）PCR反应管中分别加入30ul，转移至样本处理区。

3. 加样（样本处理区）

在PCR反应管中分别加入步骤2.9.中制备的RNA溶液及定量校准品（1-4）各10ul，盖紧管盖，简短离心，将反

应管放入荧光PCR检测仪中，记录样本摆放顺序。

4. RT-PCR反应（检测区）：

荧光信号的收集定为FAM，数据的采集定在60℃。

【结果分析】

1. 结果分析条件设定:

使用 ABI PRISM 7000荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（baseline）取6-10或6-15个循环的荧光信号；阈值（threshold）设定原则以基线刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值=40为准。定量标准曲线的相关系数应达0.97以上。

2. 质控标准

2.1 本试剂盒的定量线性范围：103≤测定结果≤108IU/ml。

2.2 将校准品1-4的浓度输入，仪器自动以定量质控参考品的拷贝数的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的相关系数应≥0.970，否则实验无效。

2.3 阴性对照测定结果为0，Ct值一栏显示为undet。

2.4 强、临界阳性对照的定量结果在试剂盒提示的规定允许范围内。

3. 结果判断

3.1 对于103≤测定结果≤108IU/ml的样本，提示本次测定结果在试剂盒有效定量检测线性范围内。可直接报告数据。

3.2 对于测定结果＞108IU/ml的样本，提示病毒含量高于试剂盒定量检测线性范围上限，所测结果仅供参考，报告上注明＞108IU/ml。如需精确定量，可根据所测结果，将该标本用阴性血清稀释至试剂盒测定范围内复测。

3.3 对于500≤测定结果＜103IU/ml的样本，提示病毒含量低于试剂盒定量检测线性范围下限，所测结果仅供参考，报告上注明＜103IU/ml，并谨慎跟踪随访。

3.4 测定结果为0（Ct值一栏为undet）的标本为HCV RNA阴性标本

【检验方法的局限性】

血浆样本不能用肝素作抗凝剂。

不能直接作为临床确诊依据，仅供临床医生参考使用。

【试剂盒性能】

检测限度为500IU/ml。

定量检测范围为1.0×103—8.0×108IU/ml。

本试剂盒对HAV、HBV、HIV、HDV、TTV、CT、NG、HSV、HPV、UU、TB标本均无非特异性扩增。

经过对临床常见高浓度胆红素、血红蛋白、血脂血浆样本的系统研究，此类样本不影响本试剂盒的定量检测结果。

经实验验证，血浆样本以EDTA、柠檬酸钠、草酸钠或ACD液抗凝，检验结果不受影响。

【注意事项】

1. 待测新鲜血清标本若不及时检测，应保存于-20℃或-70℃。

2. 试剂盒各组分使用前应充分融化混匀，离心数秒后使用。

3. PCR操作各阶段应严格分区操作。

如：PCR前准备区: 准备扩增所需试剂

样本处理区: 处待测样本和对照品

检测区: PCR扩增检测

4. 在试剂和标本准备阶段应分别使用负压超净台和生物安全柜以免污染。

5. 应穿专用工作服，戴一次性手套并经常替换，使用一次性用品。

6. PCR操作人员应具有经验和受过培训。

7. 操作过程中用到的超净台、移液器、离心机、等仪器设备应经常用10%次氯酸或70%酒精或紫外灯消毒。

8. 使用本试剂盒检测的标本具有传染性物质，请按传染病实验室检查规程操作。

9. 本试剂盒仅用于体外辅助诊断。

【生产单位】

企业名称：艾康生物技术（杭州）有限公司

地　　址：浙江省杭州市天目山路398号古荡经济园区

邮政编码：310023

电话号码：0571-87775858

传真号码：0571-********

网　　址：www.aconlab.com.cn

【医疗器械生产企业许可证编号】 浙食药监械生产许20120007号

【医疗器械注册证书编号】 国食药监械（准）字2008第3401095号

【产品标准编号】 丙型肝炎病毒核酸扩增定量检测试剂盒（PCR-荧光法）制造及检定规程

【说明书批准及修改日期】2008.09.02