三种核酸提取方法检测丙肝HCV-RNA定量的比较

韩若冰， 辛毅娟， 文　静， 张　荣， 张金花， 杨　柳*

【摘 要】摘要：目的　比较及评价3种不同核酸提取方法检测HCV-RNA结果的差异。　方法　依照美国临床实验室标准化协会(CLSI)EP9-A2 文件规定，收集40个新鲜血清标本，分别使用磁珠法、柱提法、手工法丙肝试剂以及Roche试剂进行平行检测，记录测定结果，计算线性方程及相关系数，并对其进行偏倚评估。 　结果　磁珠法和柱提法试剂与Roche试剂方法间的相关性良好(r>0.975)，而手工法与Roche试剂方法检测结果间差异超出预设允许误差范围。　结论　各方法学的试剂与Roche试剂检测结果大致相关性尚可，其中磁珠法结果较好。

【期刊名称】山西医科大学学报

【年(卷),期】2016(047)003

【总页数】3

【关键词】丙肝病毒;　磁珠法;　核酸提取

丙肝是由丙肝病毒(hepatitis virus C，HCV)引起的肝病，HCV是单股正链RNA病毒。据世界卫生组织统计，全球约有2亿人感染慢性丙肝，并面临发生肝硬化和/或肝癌的风险[1]。丙肝病毒具有很强的传染性，而且其发病没有明显的临床症状，容易失去早期治疗机会[2]。只有确诊血清HCV-RNA定量阳性的丙肝患者，才需要抗病毒的治疗[3]。现各大医院多采用磁珠法、柱提法、手工法进行丙肝RNA定量检测。

为此，我们按照美国临床实验室标准化协会(CLSI)指南文件EP9-A2要求对国产这3种方法学试剂对丙肝RNA病毒定量试剂检测结果进行了比对和偏倚评估，以了解不同方法学试剂在检测HCV-RNA定量时是否存在差异以及可比性。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　标本收集　参照文件EP9-A2[2]，收集2014-07～2015-08在本院就诊做高敏丙肝病毒RNA检测时的EDTA抗凝血标本40例。将标本按4 000 r/min离心2 min，留取血浆冷冻于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2　试剂与仪器　试剂A，B，C(试剂A为磁珠法提取试剂盒，试剂B为柱提法试剂盒，试剂C为手工法提取试剂盒)由广州中山达安公司提供；检测下限均为1×103 IU/ml，试剂D由Roche诊断产品有限公司提供，检测下限是15 IU/ml。试剂A用和实公司生产的SMART32核酸提取仪提取丙肝RNA，试剂B,C按试剂盒步骤手工操作，试剂A，B，C均使用广州中山达安试剂盒在ABI7500扩增仪进行扩增，试剂D用罗氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48检测系统及其配套试剂，实验所用试剂均在有效期内，仪器均已进行校准。

1.2　方法

1.2.1　样本测定　每天收集检测范围均匀分布的40份患者血浆标本，连续5 d，共40份样本。每份样本均严格按照试剂盒A,B,C,D说明书操作，同时各自进行双份测定，测定顺序依1-8测定第1次，再按反序8-1测定第2次，以减少交叉污染及漂移对重复测定标本平均值的影响，顺序中的浓度应尽可能随机排列。同一标本均在2 h内完成方法学测定。

1.2.2　作图及线性关系的目测检查　以Roche检测系统的测定结果为X，其余各方法学试剂的检测结果为Y，经组内、组间离群值检验后，作散点图。据图目测评价图的相对线性、足够范围和离散的均匀性。从散点图中可以较为直观地看出各方法学试剂与Roche试剂方法间的差别。

1.2.3　离群值检查　根据文献[4]，对各系统内和方法间进行组内与组间离群值检查。

1.2.4　X值合适范围的检验　根据文献进行相关系数计算[4]，如果r≥0.975，则认为X范围适合，数据满足要求。X的误差可以由数据范围给以适当补偿，并且简单的线性回归可以用来评价斜率(b)和截距(a)。

1.2.5　线性回归分析　根据文献[4]，计算两个方法间的线性回归方程：Y=a+bX。

1.2.6　预期偏倚及可信区间计算　根据文献[4]，在医学决定水平，利用回归方程计算预期偏倚及95%可信区间，以预设的允许误差10%为限，将预期偏差的可信区间与之进行比较，当预期偏差可信区间的下限<允许误差<预期偏差可信区间的上限时，实验方法与比对方法相当；当预期偏差可信区间的上限<允许误差时，实验方法与比对方法相当，偏差可接受；预期偏差可信区间的下限>允许误差时，实验方法与比对方法不相当，偏差不可接受。

1.3　统计学方法

首先对HCV-RNA病毒载量数据进行对数转换，用SPSS19.0软件进行统计处理、作图分析及偏差评估计算。

2　结果

2.1　散点图分析

结果显示，磁珠法、柱提法与Roche试剂HCV-RNA测定值呈直线关系(见图1-3)，说明其方法间相关性较好，手工法略差。

2.2　X值合适范围的检验及线性回归分析

表1结果显示，其中达安手工法r=0.973<0.975,其误差稍大，其余各方法学与Roche的高敏磁珠法相比， r≥0.975，说明测定范围足够宽，误差的影响可以忽略，也说明回归统计的斜率b和截距a可靠。

表1　各方法学相关系数及直线回归方程

Table 1　The correlation coefficient and the linear regression equation of three methods

2.3　偏差估计

计算预期偏差及其可信限范围，根据EP9-A2文献提供的公式[4]，并选择1 000 IU/ml作为HCV-RNA的检测限[5,6]，对预期偏倚及可信区间进行计算,判断两种检测方法是否相当。我们以预设的允许误差10%为限，按照“二分之一允许误差”的标准[7]，计算得其允许偏倚为50 IU/ml，由回归方程计算的预期偏差见表2，结果显示，磁珠法试剂的预期偏差95%可信区间上限小于50 IU/ml，说明其与Roche试剂偏倚可接受，试剂间检测结果具有良好的可比性，而柱提法和手工法试剂的预期偏差95%可信区间下限>50 IU/ml，说明其测定结果与Roche试剂测定结果间的差异较为显著，超出了预设的允许误差范围，方法间所得的检测结果不一致。

表2　预期偏倚与可信区间的比较

Table 2　Comparison of expected bias and confidence interval

3　讨论

患者体内的HCV-RNA病毒的有效清除与丙肝治疗的反应以及降低相关并发症的危险性息息相关[8]。高敏感度HCV-RNA定量检测已经成为丙肝治疗监测的趋势。国际公认进口Roche试剂为检测HCV-RNA定量的参比试剂。进口试剂灵敏度高、精密度好，操作简便，无人为干扰，但试剂成本较高，仪器价格昂贵，检测时间长，需要血浆量大。国产试剂基本为开放试剂，由于其试剂成本低廉，普及率很高。

笔者将三种方法学的HCV-RNA定量检测国产试剂与进口高敏感度试剂进行比较。磁珠法核酸提取是以磁珠为载体，利用磁珠在高盐低pH值下吸附核酸，在低盐高pH值下与核酸分离的原理，再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程[9]。而柱提法是试剂盒的胶回收柱采用特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA的原理，以离心吸附柱式结构高效回收核酸片段[10]。而手工法提取HCV-RNA原理则是一种简化的酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提。

本实验根据CLSI EP9-A2文件的流程[4]，对国内3种方法学试剂的测定结果进行比对。结果显示，各试剂的检测结果的重复性均较好，基本没有方法内和方法间离群值。以进口Roche试剂的检测系统为比较方法时，其余三种试剂与其线性关系良好，说明各试剂与Roche试剂的相关性尚可。进一步我们通过偏差估计发现，磁珠法与Roche试剂偏倚可接受，说明磁珠法与Roche试剂的检测结果具有较好的符合率，其原因可能是由于两种试剂方法原理一致，磁珠法是半自动化提取，人为干扰因素较小。而柱提法和手工法试剂测定结果与Roche试剂测定结果间的差异较为显著，由回归方程计算的预期偏差超出了允许误差范围，可见，柱提法、手工法试剂与Roche试剂所得的检测结果不一致。其原因可能为：①厂家引物保守序列设计不同，或试剂引物设计序列与HCV某些基因型不相匹配所致。②这两种方法均需手工操作，步骤较多，容易出现人为干扰因素。③在实验室环境中，常常会出现RNA酶对HCV-RNA的抑制现象，可能产生假阴性的结果。

以上三种方法基本涵盖目前临床上丙肝RNA定量检测的所有核酸提取方法，Roche全自动检测系统因其无人为干扰、检测限低，精密度好，灵敏度和特异性高而被国际指南推荐，而国产试剂中，磁珠法相比较有操作简便、费用低廉、与Roche试剂比较偏倚度低等优点，更合适广泛普及。

参考文献：

[1]　Cobb B,Pockros PJ,Vilchez RA,et al.HCV RNA viral load assessments in the era of direct-acting antivirals[J].Am J Gastroenterol,2013,108(4):471-475.

[2]　Razavi H,Waked I,Calinas F,et al.The present and future disease burden of hepatitis C virus(HCV) infection with today’s treatment paradigm[J].Viral Hepat，2014，21(Suppl1):34-59.

[3]　Hellard M,Rolls DA,Higgs P,et al.The impact of injecting networks on hepatitis C transmission and treatment in people who inject drugs[J].Hepatology，2014，60:1861-1870.

[4]　EP9-A2:Method comparison and bias estimation using patient samples:Approved Guideline[S].NCCLS,2002,22(19):1-52.

[5]　郑松柏,张秀明.临床检验方法学评价[M].北京:人民卫生出版社,2008:118-139.

[6]　谭跃，黄淑媛，刘勇，等.丙型肝炎病人在治疗过程中HCVRNA含量、血清抗HCV抗体及其生化指标的变化[J]．国际医药卫生导报,2009,17(15):8-11.

[7]　冯国钢．抗-HCV抗体与HCV-RNA定量检测相关性分析[J].吉林医学，2011，32(2):244-245．

[8]　Fried MW,Hadziyannis SJ,Shiffman ML,et al.Rapid virological response is the most important predictor of sustained virological response across genotypes in patients with chronic hepatitis C virus infection[J].J Hepatol,2011，55:69-75.

[9]　Tang YW,Sefers SE,Li H，et al.Comparative evaluation of three commercial systems for nucleic acid extraction from urine specime[J].J Clin Microbiol,2007(43):4830-4833.

[10]　Shepard CW,Finclli L,Alter MJ.Global epidemiology of hepatitis C virus infection[J]. Lancet Infect Dis,2005,5:558-567.