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western blotting实验操作步骤讲解

时间：2023-08-11 23:13:47 下载该word文档

蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot,WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。以下是总结WesternBlot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是WesternBlotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。方法的选择自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。
Example1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。6.分装并存于-80℃，避免反复冻融。B第二部分：相关试剂的配制：1.10%的SDS（戴口罩称取）：称取SDS10g，先加双蒸水80ml，再用磁力加热搅拌助溶，然后定容至100ml。室温保存，如在长期保存中出现沉淀，可在50℃水浴溶化后，仍可使用。2.1.5MTris/HCL（pH8.8）Trisbase18.17g，溶解于80ml双蒸水，用浓盐酸调pH至8.8，最后定容至100ml，室温下保存。

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