五种电泳技术的比较

SDSPAGE

名词解释：

相对迁移率（Rf）

问答题:

1.简述SDS-PAGE的基本原理。

2.影响SDS电泳的关键因素有哪些？

AGE

 名词解释

1.迁移率

2.电渗

3.电泳

 问答题

1.影响电泳迁移率的因素有哪些？

2.试述琼脂糖凝胶电泳分离脂蛋白的原理。

CAME

1.CAME的基本原理是什么？

2.CAME分离血清蛋白电泳时应注意哪些问题？

PAGE

名词解释

1.凝胶总浓度

2.交联度

问答题

1.与CAME相比，PAGE有哪些特点。

2.试比较CAME与PAGE操作的区别。

3.简述不连续PAGE的原理。

1.琼脂糖凝胶电泳Agarose Gel Electrophoresis

 Gel Electrophoresis ：由琼脂、琼脂糖、淀粉胶及聚丙烯酰胺等物质作支持体的电泳。

 特点（characteristic）：

1.可以制成非常均匀的凝胶，带电质点在凝胶的孔中泳动。

2. 电泳操作方法简便，电泳速度快。

3. 分辨率高，重复性好，电泳图谱清晰。

4. 适用于生化，免疫等定性定量测定。

（一）优点（advantage)

1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗。

2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。

3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。

4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。

5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定。

6.有热可逆性。

（二）缺点(disadvantage)

1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。

2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。

3.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。

4.与PAGE相比，分子筛(molecular sieve)作用小，区带少。

应用

1. 适用于大分子的核酸、核蛋白等的分离、鉴定及纯化

2. 临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的分离与检测

3. 为不同类型的高脂蛋白血症、冠心病等提供生化指标

  影响迁移的因素

 the size of the molecule

 conformation of the molecule

 the agarose concentration of a gel

 Voltage

百分浓度和分辨率限制

 Most agarose gels are made with between 0.7% (good separation or resolution of large 5–10kb DNA fragments) and 2% (good resolution for small 0.2–1kb fragments) agarose dissolved in electrophoresis buffer.

 Up to 3% can be used for separating very tiny fragments but a vertical polyacrylamide gel 聚丙烯酰胺is more appropriate in this case.

 Low percentage gels are very weak and may break when you try to lift them. High percentage gels are often brittle and do not set evenly. 1% gels are common for many applications.

琼脂糖凝胶分离血浆脂蛋白

原理： 血清脂蛋白经饱和苏丹黑B预染后，以琼脂糖凝胶为支持介质，在pH8.6巴比妥缓冲液中电泳，根据各脂蛋白的组成、大小、形状分离成不同区带。

 pH 8.6 > pI ，各种脂蛋白均带负电，电泳时由负极到正极；VLDL为圆形，受阻力小，LDL形态不规则，受阻力大，所以VLDL跑在前。

加样槽在负极，由负极到正极分别是CM\LDL\VLDL\HDL

2.醋酸纤维薄膜电泳Cellulose acetate membrane electrophoresis，CAME

特点：低吸附作用，低电渗作用，样本用量少，亲水性

1.Low sorption

2.Low electroosmosis

3.Small sample

4.Hydrophilic

电泳图谱不齐

①点样时血清点加不均匀

②薄膜局部干燥

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少

④缓冲液变质

⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行

电泳图谱分理不清

①点样时血清点加不均匀

②薄膜局部干燥

③电泳时供给薄膜的液量不均匀或过少

④缓冲液变质

⑤电泳时薄膜位置不正,与电流方向不平行

电泳速度慢

 电流过低

 供给薄膜的液量不足

 缓冲液离子强度过高

 薄膜中杂质

白蛋白区带中间部分不着色，染色不足

染色时间不够、点样过多

γ球蛋白向反方向移动

电渗现象，可提高缓冲液液面或加大电流量以改进

区带一边长一边短呈扭曲现象

薄膜未紧压在电泳槽的滤纸桥上，使薄膜接触不良而增大了电阻。

区带拖尾或区带过于紧密

缓冲液离子强度＜0.05可出现区带拖尾；离子强度＞0.075可出现区带过于紧密。

血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳Separate serum protein in cellulose acetate membrane electrophoresis

[原理] CAME是以醋纤膜（CAM）作支持物的一种区带电泳技术。

将血清样品点样于醋纤膜上，在pH8.6的缓冲液中电泳时，血清蛋白质均带负电荷移向正极。由于血清中各蛋白组分等电点不同而致表面净电荷量不等，加之分子大小和形状各异，因而电泳迁移率不同，彼此得以分离。加样：用加样器蘸取血清约5ul，垂直印在CAM粗糙面，点样区距离边缘约1.5cm，电泳时点样面朝下。加上槽盖平衡5分钟后再通电。电压10~15V/cm膜总宽。电泳40~60分钟，泳动距离约达3.5~4cm时即可断电。

由负极到正极可分为五条条带

γ β α2 α1 白蛋白

3.聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis PAGE

PAG是由丙烯酰胺（acrylamide，Acr）单体和N，N’-亚甲双丙烯酰胺（N，N，N’，N’-methylene bisacrylamide，Bis）交联剂通过自由基（ free radicals）聚合而成的一种多孔三维网状结构。

过硫酸胺[(NH4)2S2O8]（Ammonium persulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（-N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine , TEMED）为加速剂。

TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合

分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧

升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合

PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种单体的浓度决定。可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的单体浓度。

Acr/Bis：20~40 完全透明且有弹性；

＜10 很脆，易碎，不透明；

＞100 糊状不成形，易破碎

常用的标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶

交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。

C=b/（a+b）×100%

电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液

分离原理

1. 浓缩效应

1）凝胶层的不连续性

两层凝胶T与C不同孔径不同

浓缩胶孔径大，分离胶孔径小，蛋白质在大孔径浓缩胶中移动，受阻力小，移动速度快。

2）缓冲液离子成分的不连续性

甘氨酸（pI=6.0）在pH8.3带负电，朝正极移动，进入浓缩胶（pH6.7），甘氨酸解离度（）很小，有效迁移率（M ）很低，移动速度较慢，称为慢离子。

HCl 是强电解质，=1，Cl-有效迁移率大，移动速度快，称快离子。

蛋白质（pI＜6.0）带负电荷，有效迁移率介于两者之间。

3）pH值的不连续性

为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率，必须使浓缩胶与分离胶之间pH值有所区别。

3.分子筛效应与电荷效应

进入分离胶后，Gly-成为快离子

分离胶只有电荷效应和分子筛效应，根据各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分离

PAGE特点

1.具有分子筛效应，分辨率高

2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达10-6g

3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团

4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象

5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明

6.网孔可调节

4.SDSPAGE

十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS,also called lauryl sulfate)

是一种阴离子去污剂(anionic detergent )。

• 作用：破坏蛋白质分子之间以及其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质变性(denature)而改变原有的构象;

• 保证蛋白质分子与SDS充分结合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。

原理

（一）蛋白质分子的解聚
样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小(molecular mass of polypeptides )，而电荷因素可以被忽略。

1、SDS
阴离子去污剂(anionic detergent )
变性剂(denaturant)
助溶性试剂

断裂分子内和分子间的氢键(hydrogen bond)
分子去折叠
破坏蛋白质分子的二级和三级结构

2、强还原剂
巯基乙醇（β-mercaptoethanal）

二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT）

使半胱氨酸残基之间的二硫键(disulfide bond)断裂。

 SDS和还原剂的作用：
（1）分子被解聚
（2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负
电荷的蛋白质-SDS胶束。
（3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超
过了蛋白质分子原有的电荷量，消除
了不同分子之间原有的电荷差异。

去污剂的选择
无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween
Triton
阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium
bromide （CTAB）
cetylpyyridinium （CPC）
阴离子去污剂：SDS deoxycholate

电泳过程中的不正常现象
（1）“微笑”现象
指示剂前沿呈现两边向上的曲线形，说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷却不好。

2）“皱眉”现象
由于垂直电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的“三明治”底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全。

（3）“拖尾”现象
样品溶解不佳引起。

（4）“纹理”现象
由于样品中的不溶颗粒引起的。

（5）偏斜现象
电极放置不平行引起或加样位置偏斜而引起

（6）带太宽
加样量太多或加样孔泄漏引起

分子量测定

1、相对迁移率（relative mobility ，Rf）
Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝前沿的迁移距离得到的。
测量位置应在蛋白带的中央。

蛋白带迁移距离
Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离

蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离

2、作图
以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐标，Rf为横坐标绘图

3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标
准曲线上读出他的分子量

5.等电聚焦电泳Isoelectric Focusing Electrophoresis， IEFE

等电聚焦电泳(IEFE)是一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电(PI)不同的蛋白质的电泳技术。

原理： 在电泳介质中加入载体两性电解质，通电后，两性电解质会逐渐形成一个由正极到负极递增的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质移动并聚焦于与其等电点相当的pH位置。

理想的载体两性电解质应具备的特征

①化学性质稳定；

②分子量要小

→以便与被分离大分子物质分离；

③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好的缓冲能力

→梯度稳定；

④两性电解质载体的数目要足够多

→梯度平滑 ；

⑤对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度

→不影响测定。

优点：

⏹ 分辨率高（可达0.01pH单位）；

⏹ 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）；

⏹ 电泳区带狭窄；

⏹ 重复性好。

缺点：

⏹ 要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；

⏹ 由于样品中的成分会停留在其pI，不适用在pI不溶的蛋白质。

IEFE应用

⏹ 1.分析分离制备蛋白质、多肽

⏹ ①区分人血清蛋白

⏹ ②测出异常免疫球蛋白

⏹ ③基因分型

⏹ ④csf中寡克隆区带的检测

⏹ 2.测定pI可鉴定蛋白质、多肽

⏹ 3.双相电泳中，IEFE作为第一相