实验序号

5

实验项目

大肠杆菌生长曲线的测定

实验时间

2015.5.25

实验室

生化楼327

小组成员

郭小平、梁永强

一．实验目的

1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。

2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板

3.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。

4.比较不同培养基的生长曲线。

二．实验原理、实验流程或装置示意图

1 、实验原理

将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。

延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。

对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。

稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。

衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 　　

体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。

这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。

测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。

（2）、实验流程

1、设计实验方案：影响微生物生长的因素有：培养基中各组分的比例、菌悬液的加入量等，由此设计实验。

2、设计正交表：

3、实验操作：根据实验方案配制培养基、灭菌、转移菌悬液、培养、终止培养、测量OD值。

4、数据处理：比较各组生长曲线的差异、根据生长曲线的最终结果分析正交表，得出最佳的培养参数。

5、撰写报告：撰写实验报告，并进行讨论：培养基中各组分的作用，及其对大肠杆菌生长的影响。

三．实验设备及材料

大肠杆菌斜面菌种、营养肉汤培养基、生理盐水（0.85%NaCl）50mL、721型分光光度计、比色皿、恒温摇床、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、酒精灯、电炉、接种环、试管架、锥形瓶9个（250mL）、无菌吸管、烧杯（1000mL）、乳胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等

四．实验方法步骤及注意事项

实验步骤: 配制营养肉汤培养基 营养肉汤培养基灭菌 配制大肠杆菌菌液 标记 接种 培养 测定 绘制生长曲线

1.配制营养肉汤培养基:用电子天平称取1.0g酵母膏、蛋白胨1.8g和食盐2g置于1000mL烧杯中，加水至200mL，用电炉加热(加热过程中要用玻璃棒不断搅拌)至沸腾后，冷却少许后分别倒进10个锥形瓶中，每个锥形瓶倒20mL，塞上胶塞，用报纸包好，棉绳系好。

2.营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min.

3.标记:将9个锥形瓶进行标记，分别标号1、2、3……8、9、10，并标记时间为2h，4h，6h，8h，14.5h，16h，18h，20h，24h。

4.接种:用1mL无菌移液管分别移取1mL大肠杆菌菌液到已编号的9个锥形瓶中，并充分震荡均匀.

5.培养:将锥形瓶置于37℃下在恒温摇床上培养（180r/min）。然后分别按对应时间将锥形瓶取出，待培养结束时测定OD值。

7.测定:将培养的大肠菌群菌液用无菌移液管移取到比色皿中，选用600nm分光光度计上调节零点，用蒸馏水作为空白对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用自来水适当稀释后测定，使其OD值在0.1-0.65之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的OD值。

8.绘制生长曲线:对所得数据进行生长曲线的绘制，分析实验结果。

24h大肠杆菌OD值

六．参考文献

[1].周德庆，胡宝龙. 微生物学实验教程. 第2版. 北京: 高等教育出版社, 2006.

[2].杨革.微生物学实验教程. 第2版. 北京: 科学出版社, 2010.

[3].何国庆，贾英民，丁立孝等. 食品微生物学. 第2版. 北京: 中国农业大学出版社，2009.