分子荧光法测定蒽

一、 实验目的

1. 掌握荧光光度分析法的基本原理和方法以及荧光激发光谱和发射光谱的关系；

2. 掌握荧光光谱仪的基本组成及使用方法；

3. 掌握荧光光谱定量分析的基本方法。

二、 实验原理

处于基态的荧光物质分子吸收与其对应的特征电子能级相一致的光能后，将跃迁到能量较高的电子激发态。处于较高电子激发态的分子，经振动弛豫、内转换等非辐射方式跃迁到单重激发态的最低振动能级，然后在10-9~10-7s的短时间内发射光子返回基态，产生分子的荧光发射光谱。

每种荧光物质都具有特征的荧光激发光谱和荧光发射光谱，通常荧光发射光谱和它的激发光谱呈镜像对称关系。

对同一物质的稀溶液而言，荧光强度If与该物质的浓度c有如下关系：

当入射光强度I0和吸光光程l一定时，上式可简写为：。式中K为常数。因此，在低浓度下，荧光物质的荧光强度与浓度成线性关系，可利用标准曲线法对低浓度荧光物质进行定量分析。

三、 仪器与试剂

仪器：荧光分光光度计（光谱仪）。容量瓶若干。试剂：10 mg·L-1蒽标准储备液。

四、 实验步骤

1. 测量溶液的配制

准确移取10 mg·L-1蒽标准储备液0.5、1、1.5、2和2.5mL于5个50mL容量瓶中，分别加入无水乙醇稀释至刻度，所得溶液浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg·L-1。

2. 激发光谱和发射光谱的绘制

开启仪器，预热10分钟，预扫描确定最佳激发波长和发射波长，在最佳发射波长下绘制激发光谱；在最佳激发波长下绘制发射光谱。改变不同的激发光波长，观察激发光波长对荧光发射光谱的影响。

3. 不同浓度下荧光光谱的绘制

分别对浓度为1.00、2.00、3.00、4.00和5.00 mg·L-1的蒽的无水乙醇溶液扫描荧光光谱，并进行比较，观察浓度对荧光光谱的影响。

4. 蒽样品的定量分析

（1）标准系列溶液荧光强度的测定

分别由稀到浓测定浓度为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg·L-1的蒽的无水乙醇溶液的荧光强度。

（2）未知样品的测定

取待测样品，用与测定标准溶液时相同的条件，测定其荧光强度。

五、 数据及处理

1．用标准系列溶液的荧光强度，以溶液浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标，绘制标准曲线。

2．根据待测试样的荧光强度，从标准曲线上求得其浓度。

六、 思考题

1．为什么荧光发射光谱与激发波长无关？

2．为什么荧光物质的最大发射波长总是大于最大激发波长？