现代生物技术的组成：

生物技术、基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程、分子进化工程、酶的定向进化、生物工程下游技术

生物技术：是利用生物体系，应用先进的生物学和工程学技术，加工或不加工底物原料，以提供所需的各种产品，或达到某种目的的一门新型跨学科技术

基因工程：用人工的方法把不同生物的遗传物质分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，通过载体将目标基因导入到宿主细胞或个体，从而改变宿主遗传特性或获得基因表达产物的技术

细胞工程：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养，繁殖，或按人们的需求设计改变细胞的某些生物学特征，从而获得某些有用的物质，或改良生物品种和创造新品的技术

发酵工程：利用生物细胞的某种特性，通过现代化工程技术手段进行工业规模化生产人类所需产品的技术

蛋白质工程：是以蛋白质结构，功能研究为基础，运用生物化学，分子生物学，遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成编码蛋白质的基因入手，定向的改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构性质和功能，能更好的为人类服务的一种生物技术

分子进化工程：是在试管或实验室中模拟生物分子的进化，使长期的自然进化在实验中短期能实现

酶的定向进化：是在试管中模拟自然进化过程的人工进化策略，利用酶基因的突变或同类酶基因片段的重组，构建某个酶的随机基因突变库，通过基因操作的方法使这些基因在微生物在表达，人工控制条件筛选出人们所需的酶

生物工程下游技术：指从基因工程中获得的动，植物和微生物的有机体或器官上，从细胞工程，发酵工程和酶工程产物中把目标化合物分离纯化出来，使之达到商业应用的目的的过程

酶工程:是利用酶，细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或通过对酶的分子结构修饰或改造以改善酶的特性，借助于生物反应器和工艺优化，有效的发挥酶的催化特性生产人类所需产品的技术

基因工程的基本过程：

①获得目的基因 ②将目的基因与载体连接形成重组DNA

③将重组DNA导入受体细胞 ④筛选出能表达目的基因的受体细胞

基因工程的工具酶：

基因工程操作中，作为工具对基因进行切割和拼接等操作的酶，到目前为止，常用工具酶共300多种

工具酶的分类：限制性内切酶、连接酶、聚合酶、碱性磷酸酶、逆转录酶

限制性内切酶：内切核酸酶中能够识别ＤＮＡ分子上某些特定的核苷酸序列并且将其切开的酶，称为限制性内切酶

有三种：Ⅰ型限制性内切酶 Ⅱ型限制性内切酶 Ⅲ型限制性内切酶

I型限制性内切酶：是多聚体蛋白，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在

II型限制性内切酶：是一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段。EcoRI是最早发现的II型限制性内切酶

III型限制性内切酶：识别一定的位点，但切割位点通常在识别位点一侧24bp-26bp处

I型限制性内切酶和III型限制性内切酶的切点不固定，不能产生可利用的DNA片段。II型限制性内切酶具有控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段。基因工程所用的限制性内切酶都是II型限制性内切酶

II型限制性内切酶的识别特点和切割特性：①II型限制性内切酶识别序列的长度，一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基； ②其识别位点一般都是回文结构； ③产生不同的末端：黏性末端、平齐末端

黏性末端：限制性内切酶错位切割DNA双链而形成的互补的单链末端（双链DNA中没有配对的碱基末端）

平齐末端：有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子

同裂酶：是指来自不同有机体但识别和切割相同DNA序列的酶

同尾酶：来源不同，识别序列不同，但切割DNA分子后产生的黏性末端相同

杂种位点：由一对同尾酶分别产生的黏性末端共价结合形成的位点。一般不能被原来的任何一种同尾酶识别

限制性内切酶的主要用途：

①在特异性位点上切割DNA，产生特意新限制性内切酶切割的DNA片段 ②建立DNA分子的限制性内切酶物理图谱

③用限制性内切酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA ④构建基因图库

DNA聚合酶：以DNA为模板，将DNA由5’端点开始复制到3’端的酶。

常用：大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）、耐热DNA聚合酶、 逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）、T4噬菌体DNA聚合酶、 T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序酶

Klenow片段作用：①补平限制性内切酶切割DNA所产生的3’凹端 ②以（32P）标记的dNTP补平3’凹端，可对DNA分子进行末端标记 ③对DNA分子的3’突出尾进行末端标记 ④在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链 ⑤应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序

耐热DNA聚合酶的作用：①DNA测序 ②通过聚合酶链式反应对DNA分子的特定序列进行体外扩增

DNA连接酶：能够将两段DNA拼接起来的酶叫做DNA连接酶

连接酶分类：①大肠杆菌连接酶（需要NAD+，只能连接黏性末端DNA片段）

②T4噬菌体DNA连接酶（需要ATP，能连接黏性末端，也能连接平齐末端）

影响连接反应的因素：①温度 ②DNA末端特性 ③DNA末端的浓度和分子量

碱性磷酸酯酶：是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5’磷酸基，即脱磷酸作用

S1核酸酶： 来源：是从米曲霉中提取的

活性：特异性单链核苷酸外切酶，能降解单链DNA和单链RNA，不能降解其双链DNA和RNA的杂合子

基因工程的载体：承载并携带目的基因进入受体细胞，并使目的基因得以复制或表达的DNA分子

理想载体的特征：

①插入外源基因前后均能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制

②有适当的限制性内切酶单一酶切位点，且位于DNA复制的非必需区

③具有能够直接观察的表型特征，作为重组DNA选择的标志。

④易于从宿主细胞中分离，并进行纯化

载体的分类：①按照介导的作用目的（克隆载体、表达载体） ②按照导入的受体生物（原核生物大肠杆菌载体、酵母载体、植物载体、动物载体） ③根据赋予宿主的形状（F质粒、R质粒、降解质粒）

原核生物载体：细菌质粒载体、λ噬菌体载体、M13噬菌体载体、柯斯质粒载体

蓝白斑筛选重组子的原理：lacZ编码β半乳糖苷酶的α肽，在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷的诱导下，使呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷被分解为半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。因此携带空载体的大肠杆菌呈蓝色菌落。外源基因的插入使α肽失活，因此携带外源基因的重组子菌落呈白色

λ噬菌体DNA：λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp。两端各有12个碱基的5’凸出，黏性末端是互补的，进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。

包含3个部分：①左臂（构成头部和尾部外壳蛋白基因） ②中臂（非必需区，可用于改造） ③右臂（λDNA复制和溶菌有关的蛋白质编码基因）

柯斯质粒载体：一类由人工构建的含有λDNA的cos位点和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。也叫黏性质粒或黏粒

基因组组成：①1个质粒复制起始区域复制子 ②1个λ噬菌体黏性末端片段cos位点

③至少1个限制酶的单一识别切割位点 ④至少1个抗药性选择标记基因

特点：①具有质粒载体的特性 ②具有λ噬菌体载体的特性

③具有高容量的克隆能力。可插入30-45kb的外源DNA

基因工程的受体：基因工程的受体是指在转化、转导、杂交中接受外源基因，并能支持质粒、病毒进行复制扩增和表达的细胞或生物体，受体也叫宿主

受体应具备的性能：①具有接受外源基因的能力，并利于表达 ②能表达由导入的重组体分子提供的某些表型特征，以利于转化子细胞的选择和鉴定 ③不适合于在人体体内或非培养条件下生存，有利于安全

基因工程的研究方法：①目的基因的制备 ②目的基因与载体的重组

③重组体DNA导入受体细胞 ④克隆子和筛选与表达产物的检测

目的基因：是指根据基因工程的目的和设计所需要的某些DNA分子的片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码

制备方法：

①目的基因的直接分离法（限制性内切酶法、物理化学法、酶促逆转录合成法）

②基因文库筛选法（鸟枪法、基因组文库法、cDNA文库法）

③聚合酶链式反应法 ④基因的化学合成法

酶促逆转录合成法：利用逆转录酶以mRNA为模板合成相应的DNA方法。主要用于合成分子量大而又不知其序列的基因

基因组文库：指汇集某一基因组所有DNA序列的重组DNA群体。通常是以λ噬菌体作为载体构建的

cDNA文库：以某种生物成熟的mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。常以λ噬菌体和质粒作为载体构建

聚合酶链式反应法（PCR）：当知道目的基因的序列或其两侧的序列时，可以通过合成一对与模板DNA互补的引物，十分有效的扩增出含有目的基因的DNA片段

反应体系：①作为模板的目的DNA序列 ②与目的基因两条链的各自3’端序列互补的DNA引物

③TaqDNA聚合酶 ④4种核苷酸4×dNTP ⑤反应buffer：Mg2+

基本过程： ①变性（高温90-96℃下使DNA分子解链） ②退火（降温25-65℃使DNA分子重新配对，引物与模板结合） ③延伸（72℃下，Taq酶作用，合成DNA分子）

目的基因与载体的重组：（基因重组）：利用限制性内切核酸酶和其他一些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基因，并将两者连接起来。这种连接主要靠T4DNA连接酶。

包括：亚克隆、黏性末端连接、平端连接、人工接头连接、同聚物加尾连接

亚克隆：把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型的载体的过程称为亚克隆。

黏性末端连接：①同一限制酶切位点连接 ②不同限制酶切位点连接

平端连接：具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接

人工接头连接：是人工合成具有特定限制性内切核酸酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。将人工接头接在目的

基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切核酸酶位点，应有相应的内切核酸酶切割，就可以得到互补的黏性末端

重组体DNA导入受体细胞：在目的基因与载体连接成重组DNA分子后，下面的重要工作主要是将重组DNA导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子么这就是外源基因的无性繁殖，即克隆

根据受体生物，将重组体导入受体细胞分为：大肠杆菌转化法、酵母转化法、植物细胞转化法、动物细胞转化法

大肠杆菌转化法： ①氯化钙转化法 ②电穿孔法 ③转导

氯化钙转化法（是将重组体通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程），

通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞

操作方法：将对数长期的大肠杆菌细胞悬浮于用冰预冷的低渗CaCl2溶液中，使细胞通透性增加；将重组DNA加入感受态细胞悬浮液，使DNA与Ca2+形成复合物，吸附于细胞表面，经42℃短暂热处理，促使外源DNA进入感受态细胞

电穿孔法（利用高压脉冲使细胞膜形成小孔而导入外源DNA的技术）

酵母转化法：①完整细胞转化法 ②原生质体转化法 植物细胞转化法：①载体转化法 ②基因直接转化法

基因直接转化法：是指不需要载体，而利用物理、化学的方法将外源基因导入受体植物细胞的技术。

克隆子的筛选与表达产物的检测：将重组DNA导入受体后的下一个工作是：从转化细菌菌落中筛选出含有阳性重组DNA分子的菌落，或检测转化后的受体能否表达目标产物。

克隆子的筛选鉴定方法：①利用抗生素抗性基因筛选

②核酸分子杂交（点杂交、Southern blot—DNA、Northern blot—DN菌落杂交技术）

③报告基因检测方法 ④利用噬菌斑的形成进行筛选 ⑤利用遗传互补作用进行筛选 ⑥重组DNA电泳

基因工程在食品中的应用：

1、基因工程与食品原料改良 ①对食品原料品质的直接改良 ②培育抗性动植物新品种 ③改良微生物的菌种特性

2、基因工程与食品贮藏保鲜 ①PG基因工程 ②ACC合成酶基因工程

3、基因工程与食品加工 4、基因工程与食品新资源的开发 5、基因工程与食用疫苗

对食品原料的直接改良：①改良植物蛋白品质 ②通过基因工程改良脂肪酸的组成 ③通过基因工程增加果实的甜度 ④提高果实可溶性固形物的含量 ⑤提供维生素、微量矿物元素的含量 ⑥改良植物淀粉 ⑦提高动物源食品的生成效率及品质

转基因食品：是指用转基因生物制造、生产的食品原料、食品及食品添加剂等，简称GMF

实质等同性：是如果某种转基因食品成分与和已经存在的某一食品或成分在实质上相同，那么在安全性方面，前者可以与后者等同处理。

发酵工程：利用生物细胞（或酶）的某种特新，通过现代化工程技术书段进行工业化规模化生产人类所需产品的技术

发酵工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、其他微生物（藻类、病毒）

原生质体育种：细胞壁是微生物细胞间进行物质交换的主要障碍之一，将细胞壁除去后，在原生质体融合时又加入融合促进剂可导致原生质体间高频率的杂交

①原生质体制备 ②原生质体融合 ③原生质体再生 ④融合子的选择

发酵培养基：人工制备的、适合不同微生物生长繁殖以及积累代谢产物的营养物

培养基应满足的条件：①来源丰富、供应充足、价廉物美 ②单位质量的底物产生最大的菌体和产物得率

③产物合成速率高 ④副产物的生成少 ⑤减小通风搅拌、后期产物的提取、纯化难度低

按培养基外观的物理状态分类：

①固体培养基：比较适合于菌种的分离和保存以及曲霉和真菌的生产。主要成分有、麸皮、大米、小米、小米、木屑、稻糠和琼脂等

②半固体培养基：即配好的液体培养基中加入琼脂，一般用量为0.5%-0.8%，主要用于鉴定菌种，观察细菌运动特征，及噬菌体的效价测定

③液体培养基：80%-90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的营养成分，它流动性好、输送方便，由于氧气、营养物质和能量的传递，有利于发酵参数的控制，是摇瓶发酵和大规模工业发酵最常用的培养基

发酵工业中常用的原料：

①工业上常用碳源（碳源是合成菌体和目的产物的碳成分，为微生物菌种的生长繁殖提供能源）

②工业上常用氮源（氮源分为无机氮源和有机氮源，有机氮源有利于微生物生长）

③无机盐（根据微生物对无机盐的需求量，将无机盐分为主要元素和微量元素两类）

④水（天然水含有不同类型和不同量的矿物质，具有一定的硬度和碱度，水的质量对微生物的生长和发酵产物的形成具有一定影响，通常利用絮凝法、离子交换法、电渗析法、反渗析法进行处理）

⑤生长因子（生长因子是一类对微生物正常代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成的有机物。需要量不大，但却是有些微生物代谢所必需的）

⑥前体（指在产物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质）

⑦产物促进剂

发酵培养基加热灭菌的应用：①实罐灭菌法（分批式灭菌） ②连续灭菌法

发酵过程的优化与控制：

生物培养基与发酵同时受到细胞内部遗传特性和外部发酵条件两个方面的制约。

1、温度对发酵的影响及其控制

①发酵热：包括生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热

生物热：发酵初期，呼吸作用缓慢，产生热量少；对数生长期菌体繁殖快，代谢旺盛。产生热量多；平衡期菌体浓度大，代谢旺盛，产生热量最多；发酵后期产热不多

搅拌热：机械搅拌带动发酵液运动，造成液体之间、液体与设备之间的摩擦作用，产生热量，称为搅拌热

蒸发热：通风时，引起发酵液部分热量通过罐体向外辐射。

②温度对发酵的影响和控制措施

低于最低生长温度，微生物不生长，一定温度内，菌体随温度上升而生长代谢加快，温度上升，酶失活速度加快。同一种微生物的不同生长阶段对温度的敏感性不同，延迟期对温度十分敏感，稳定生长期对温度不敏感。同一株生产菌在不同的发酵温度下会产生不同的代谢产物；同一菌株，其细胞生长和代谢产物积累的最适温度往往不同

2、溶解氧对发酵过程的影响

①溶解氧浓度对发酵的影响及监控

发酵前期：需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降；；发酵中后期：呼吸强度变化不大，溶解氧浓度变化较小；；发酵后期：菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也逐渐上升

②影响氧传递的因素

溶氧的控制措施：a提高饱和溶解氧浓度 b降低发酵液中氧浓度 c提高液相体积氧传递系数

3、pH对发酵的影响及其控制

①微生物对pH的需求（大多数细菌的最适pH值为6.5-7.5，霉菌最适pH为4.0-5.8，酵母菌的最适pH为3.8-6.0）

②生长和发酵产物最适pH值（往往是不同的）

③酶的激活或抑制（pH的改变通过引起某些酶的激活或抑制，使菌体代谢途径发生改变，代谢产物发生变化）

④引起发酵液pH下降的因素（碳源比高） ⑤引起发酵液pH上升的因素（氮源比例失衡）

⑥发酵过程中pH的控制（根据不同微生物特性、根据发酵过程中的pH要求，控制适当的pH）

⑦发酵过程pH值调节和控制（调节原始pH值，选用不同代谢速度的碳源和氮源，补料，加入弱酸或弱碱）

4、二氧化碳对发酵的影响和控制

二氧化碳既是微生物的代谢产物，也是某些微生物代谢的基质，对生长具有直接影响。常用通风搅拌的方法控制

5、发酵过程的中间补料措施

发酵过程可以分为 分批发酵、分批补料发酵、连续发酵

补料：是指发酵过程中补某些维持微生物的生长和代谢产物积累所需要的营养物质

（补充碳源、补充氮源、补充微量元素/无机盐、补充前体）

6、泡沫控制

发酵过程中产生大量泡沫的原因：

①外界引进的气流被机械地分散形成泡沫 ②发酵过程中产生的气体聚结形成的发酵泡沫

产生泡沫的不利影响：①引起发酵液溢出排气口，造成逃液，导致产物损失 ②泡沫上升到罐顶，使培养基从搅拌轴处渗出，造成菌体污染 ③泡沫会减少装料系数，降低设备利用率 ④影响通风搅拌效果及氧传递，造成发酵异常⑤影响菌体正常呼吸作用 ⑥使微生物群体的非均一性增加 ⑦是微生物菌体提早自溶

泡沫的消除：机械法（机械力打碎泡沫，促使气泡破裂） 化学法（使用化学消泡剂）

7、杂菌与噬菌体污染的控制

发酵工程在食品工业中的应用

1、传统发酵食品生产

①传统发酵粮食食品——黄酒的生产 ②传统发酵豆类食品——酱油的生产

③传统发酵蔬菜食品——泡菜的生产 ④传统发酵乳制品——酸乳的生产

⑤传统发酵肉制品——火腿的生产

2、发酵法生产功能性食品

①真菌多糖 ②生物活性肽—谷胱甘肽 ③功能性微生态制剂 ④功能性微量元素 ⑤功能性不饱和脂肪酸

3、发酵法生产食品添加剂

①黄原胶 ②有机酸—乳酸 ③色素—红曲色素 ④防腐剂

4、发酵工程与食品废弃物的处理——食品工业废水的处理方法（物理法、化学法、生物法）

曝气活性污泥工艺：向食品加工废水中不断地充入空气，使水中有足够的溶解氧，为好氧微生物生长繁殖创造良好的条件，经过一定时间后，就会产生一种褐色絮状泥粒，其中含有大量的微生物，这种充满微生物的絮状泥粒，叫做活性污泥。活性污泥结构松散，表面积很大，具有很强的吸附和氧化分解有机物的能力

酶：是由活细胞产生的，对其特异底物具有高效催化作用的生物大分子

根据酶分子的组成分类：单纯酶（有些酶分子仅由氨基酸组成，没有辅助因子，如脲酶、淀粉酶）

结合酶（是除了在其组成中含有氨基酸组成的蛋白质部分外，还含有非蛋白成分）

酶的活性中心：指必需基团在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物

酶工程：是利用微生物发酵生产酶制剂，或利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能，或通过对酶的分子结构修饰或改造以改善酶的特性，借助于生物反应器和工艺优化，有效的发挥酶的催化特性生产人类所需产品的技术

酶的生产方式：化学合成法、从生物体内直接提取分离、微生物发酵生产制取特定的酶（主要方式）

从生物体内直接提取分离：采用各种技术，直接从动植物或微生物的细胞或组织中将酶提取出来

微生物发酵生产制取特定的酶

发酵方法与控制：根据微生物培养方式不同，可分为固体培养发酵、液体培养发酵

固体培养发酵：以麸皮、米糠为基本原料，加无机盐和适量水分进行微生物培养的方法

液体培养发酵：利用合成的液体培养基在发酵罐内进行搅拌通气培养，是目前主要方式

提高酶产量的方法：通过酶的合成调节机制提高酶的产量（诱导酶合成调节、酶合成的反馈阻遏、分解代谢对酶合成的阻遏作用）、通过基因突变提高酶产量、通过基因重组提高酶产量、通过发酵条件控制提高酶产量、添加诱导物、添加表面活性剂、添加产酶促进剂

分解代谢对酶合成的阻遏作用：又叫葡萄糖阻遏。葡萄糖利用某些容易利用的碳源，其分解代谢产物阻遏某些诱导酶体系编码的基因转录的现象

酶工程的研究内容：化学酶工程、生物酶工程

化学酶工程：也称为初级酶工程，是指自然酶、修饰酶、固定化酶及化学人工酶（模拟酶）的研究与应用

生物酶工程：是酶学和以DNA重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物，因而也叫高级酶工程

化学酶工程：①自然酶的开发

②固定化酶（指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续的进行有效催化反应的酶）

③化学修饰酶（通过对酶分子的化学修饰，以改变酶的结构、改善酶的性能。常采用酶分子功能基团修饰和交联反应、酶与高分子结合等方法）

④人工合成酶（化学合成的具有与天然酶相似功能的催化物质。在深入了解酶的结构和功能及催化作用机理的基础上，模拟酶的功能，用化学方法合成的催化剂。可以是蛋白质，也可以是较简单的大分子物质）

酶的固定化技术：可大致分为四类，即吸附法、包埋法、共价结合法、交联法

酶分子的化学修饰：指在体外利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某种氨基酸残基产生化学反应，使某些化学物质或基团结合到酶分子上，或将酶分子的某部分删除或置换，从而改造酶分子的结构与功能

方法：金属离子置换修饰、大分子结合修饰、肽链有限水解修饰、交联修饰、酶分子侧链基团修饰

金属离子置换修饰：有些酶分子中含有金属离子，而且往往是活性中心的组成部分，对酶的催化功能起重要作用。酶分子中的金属取代可以改变某些酶的专一性、稳定性及抑制作用

过程：酶的分离纯化、除去原有的金属离子、加入置换离子

大分子结合修饰：利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能

肽链有限水解修饰：通过肽链的有限水解，使酶的构象发生变化，从而改变酶的特性和功能的方法

交联修饰：应用双功能基团试剂使酶分子内或分子间肽链发生交联反应的修饰

酶分子侧链基团修饰：通过基团专一性试剂与酶分子侧链上特定的功能团发生化学反应，引起酶分子的空间构想发生改变，从而改变酶分子特性和功能的修饰方法。（可用于研究各种基团在酶分子中的作用和影响）

化学人工酶：用有机化学和生物学方法合成的具有特定催化功能的酶的模拟物。

人工酶的制作：①半合成酶（与金属或金属有机物的结合）

②全合成酶（小分子有机物全合成酶、抗体酶、印记酶）

抗体酶：在免疫球蛋白的易变区引入催化基团形成的人工合成酶（拷贝法、引入法、诱导法）

印记酶：分子印迹是指以天然生物材料为骨架，通过模板产生特异性识别空腔的技术。印记酶是用分子印迹技术制备的人工酶，又称人工聚合物酶

制备生物印记酶的过程：①使蛋白质变性，扰乱其天然构象，使其构象柔曲更有可塑性

②加入模板分子，使模板分子与变性蛋白质充分混合

③代模板分子与蛋白质相互作用后，用交联剂交联蛋白质，固定其与模板分子相结合的构象

④待透析或其他方法除去模板分子，产生具有新的活性中心的蛋白质空穴

酶的定向进化：是在试管中模拟自然进化过程的人工进化策略，利用酶基因的突变或在同类酶基因片段的重组，构建某个酶的随机基因突变库，通过基因操作的方法使这些基因在微生物中表达，人工控制条件筛选出人们所需的酶 （基本策略：构建基因突变库 途径：点突变、体外重组）

典型酶分子定向进化步骤：①选择目的基因 ②构建基因变异库 ③变异基因与表达载体连接 ④克隆基因向宿主的转导

⑤筛选进化的基因 ⑥分离改良的基因 ⑦多次反复循环上述进化，积累改良结果，最后得到所需酶基因

点突变的方法：易错PCR、化学诱变剂介导的随机突变

易错PCR：是通过使用特定条件的PCR对基因进行体外扩增，使扩增的基因出现少量碱基误配，引起突变，构建突变库，然后选择或筛选获得突变体（关键是控制突变率）

易错PCR是通过采用提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种dNTP的浓度、使用低保真的Taq酶创造随机突变

体外重组：DNA序列改组、体外随机引导重组、交错延伸技术、基因家族改组

DNA序列改组：又称有性PCR，即从正突变基因库中分离出的DNA用DNA酶活限制性内切酶随机切成片段，随机片段经过不加引物的多次PCR循环，在PCR循环过程中随机片段之间互为模板和引物进行扩增，直到获得全长的基因

交错延伸技术：选择两个亲本基因，使它们变性成单链，在PCR反应中，把常规的退火和延伸合并为一步，并大大缩短其反应时间，引物在DNA聚合酶催化下只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火并进一步延伸，重复这一过程直到全长序列形成

酶反应器：以酶活固定化酶作为催化剂进行酶促反应的装置

根据几何形状或结构分类：罐型、管型、膜型

按进料和出料方式：分批性、半分批性、连续式反应器

按其功能结构：膜反应器、液固反应器、气液固三相反应器

按照结构的不同：搅拌罐式反应器、填充床反应器、流化床式反应器、鼓泡式反应器、模式反应器、喷射式反应器

固定床式反应器：将颗粒状、板状或纤维状的固定化酶填充在固定床中，底物按一定方向通过固定进行反应的装置

酶传感器：以固定化酶作为感受器，以基础电极作为换能器的生物传感器

根据感受器与基础电极结合方式不同分为：电极紧接型、液流系统型

酶传感器的制备：①选择酶（选择能专一性催化目的物质发生化学反应的酶）

②酶与固相载体结合成固定化酶 ③选择基础电极

酶工程在食品工业中的应用：

1、酶工程在食品加工

①淀粉糖加工 ②乳制品加工 ③果蔬加工 ④鱼肉制品加工 ⑤油脂改良 ⑥啤酒酿造 ⑦烘烤食物

2、酶工程与食品添加剂

①高甜度甜味剂：阿斯巴甜 ②5'-鸟苷酸 和5'-肌苷酸 ③单甘脂 ④β-环糊精的酶法生产

3、酶工程与功能性食品配料 ①低聚糖 ②果葡糖浆 ③水解动植物蛋白 ④酵母提取物

4、酶工程提高食品资源利用效率 ①提高植物原料的淀粉提取率 ②酿酒工业与出酒率的提高

5、新型酶制剂及其应用

①微生物原果胶酶的研究进展 ②氨肽酶和羧肽酶及其在蛋白水解物脱苦中的应用

③植酸酶的研究进展 ④漆酶的研究进展 ⑤极端酶研究进展

细胞工程：是指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养，繁殖，或按人们的需求设计改变细胞的某些生物学特征，从而获得某些有用的物质，或改良生物品种和创造新品的技术。

进行体外培养细胞，需要从外部调节、内部调控两方面着手

细胞群体的生长，一般分为滞后期、对数生长期、稳定器、衰亡期

细胞全能性：一个与合子具有相同遗传内容的体细胞具有产生完整生物个体的潜在能力

细胞工程主要内容：①大规模的细胞培养（包括单个细胞培养、组织培养、器官培养）

②细胞融合（又称体细胞杂交，是利用自然或人工的方法使两个或几个不同的细胞融合为一个细胞）

③细胞拆分（又称细胞质工程，是通过物理或化学方法将细胞质与细胞核分开，再进行不同细胞间核质的重新组合，重建成新细胞。也包括各种细胞器的分离和重新组合）

④繁殖生物学技术（主要包括体外受精技术、胚胎移植技术、动物克隆）

⑤染色体工程（是按照人们的需要来添加或减少一种生物的染色体，或用别的生物的染色体来替换）

⑥染色体组工程（是改变染色体组数的技术）

细胞工程的主要技术：①无菌操作计数 ②细胞培养技术 ③细胞融合技术 ④细胞拆分技术

细胞培养技术：①要取材和除菌 ②配置培养基、灭菌、接种

细胞培养（是指在动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的保存和生长）

细胞融合技术：是指不同的细胞在离体条件下接触，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程。又称原生质体融合

细胞融合的操作程序：原生质体的制备、诱导细胞使之发生融合、筛选杂种细胞、杂种细胞的培养

诱导细胞融合的主要方法：①生物学法 ②化学因子诱导细胞融合 ③电诱导细胞融合

化学因子诱导细胞融合：采用化学融合剂促进细胞融合（主要化学融合剂有聚乙二醇PEG、二甲基亚砜DMSO、高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子）（PEG的优点：通用性好，能诱发植物细胞融合，促使动物细胞融合……）

电诱导细胞融合：在电场中使细胞极化成偶极子，并沿电力线排列成串，然后用高强度、短时间的电脉冲击穿细胞膜，使其产生小孔，从而使两个或几个相互靠近的细胞融合在一起（对原生质体损害小、效率高、具有普遍性）

原生质体的再生：原生质体重新生长出细胞壁，回复到完整细胞形态的过程

影响再生因素：①菌体生长状态 ②酶浓度及作用时间 ③再生培养基 ④残存菌体的分离 ⑤原生质体的密度

融合子：原生质体融合后，来自两个亲本的遗传物质经过交换并发生重组而形成的子代

杂合子筛选手段：

①直接法：对于营养互补型的亲本，可以不补充两亲本生长所需营养物的再生基本培养基上直接筛选；对于以抗药性作为选择标记的融合，可从含药物的平板培养基上分离鉴定；对形态特征或色素方法的标记，其融合子可根据色素、形态特征来分析鉴定

②间接法：将融合液涂布于营养丰富的再生培养基上，使未融合的和融合的都生长出来，然后用影印法接种在对应的基础培养基或选择培养基上，经过对照选出杂合子

动物细胞培养：将动物细胞或组织从机体中取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，在无菌、适温、丰富的营养条件下，使细胞在体外继续生长和增殖。整个过程细胞不出现分化，不形成组织

根据是否能贴附于支持物上生长的特性，分为：

悬浮型细胞：是指生长时呈悬浮状态的细胞

贴附型细胞：是指贴附于支持物上生长的细胞。多数细胞为贴附型，生长时能贴附在支持物上

原代培养：以直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养

传代：将细胞从一个培养容器转移或移植到另一个培养容器，即传代或传代培养

细胞接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加

动物细胞培养基：根据培养基的来源及成分的明确程度划分为：

①天然培养基阶段：直接采用某些组织的凝块、生物性液体和组织提取液等作为细胞额培养基

优点：营养成分丰富、培养效果好 缺点：成分复杂、来源受限

②合成培养基阶段（在合成培养基中都或多或少加入一定比例的天然培养基，比例由百分之几到百分之几十不等，实际操作中，这种培养基应成为半合成培养基）

③无血清培养基：为深入研究细胞生长发育、分裂繁殖以及衰老分化的生物学机制而研制的，主要是由基础培养基和替代血清的补充因子组成（补充因子：用来替代血清中含有的动物细胞培养时所需要的各种因子）

无血清培养基作用：避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。可使不同细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养

动物细胞培养方式：灌注悬浮培养、贴壁细胞培养、固定化细胞培养、微载体培养

悬浮培养（非贴壁依赖性细胞培养）：是指利用旋转、振摇或搅拌的方法使细胞始终处于悬浮状态，并在此状态下生长繁殖的方法。主要用于悬浮生长的细胞培养。如来源于血液、淋巴组织的细胞核肿瘤细胞

优点：对设备要求简单、并可借鉴微生物发酵的部分经验和放大规律

缺点：培养的细胞密度低且容易发生变异，有潜在的致癌危险

贴壁依赖性细胞培养：是指必需贴附于固体介质表面上才能生长的细胞培养，主要用于非淋巴细胞等贴壁依赖性细胞的培养。大多数动物细胞都属于这一类型

细胞贴壁步骤：贴壁因子吸附于培养基表面、细胞与表面接触、细胞贴附于培养基表面、贴壁细胞在培养基表面扩展

微载体系统：所用微载体是由天然葡萄糖聚合物或其他聚合物制成的固体小珠。细胞可贴附于微载体表面上，并悬浮于培养基中，逐渐生长成细胞单层。该方法将贴壁培养和悬浮培养融为一体

优点：具有比表面积大，由于微载体的比表面积大，单位体积培养基细胞产率高。微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了这些环境因素的监测和控制。收获过程简单，劳动强度小，占用空间小

细胞移植技术：指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，利用显微手术和细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新组成胚胎并使之发育成熟的过程

动物细胞工程在食品中工业中的应用

1、动物细胞培养技术 2、细胞核移植技术 3、动物细胞融合技术

4、动物细胞的冻存，复苏和运输

植物细胞工程：是指以植物细胞为基本单位在离体条件下进行培养，繁殖或人为的精细操作，使细胞的一些生物学特性发生改变，达到改良品种或生产生物产品的目的

外植体：植物组织培养中作为离体培养材料的器官或组织的片段统称为外植体

愈伤组织：是由母体外植体组织的增长细胞产生的一团不定型的疏松排列的薄壁细胞

植物细胞培养的类型和方法：

1、按培养对象 ①单细胞培养 ②原生质体培养 2、按培养基分 ①固体培养 ②液体培养

3、按培养方式 ①摇瓶悬浮培养 ②固定化细胞培养

原生质体的分离：植物体的幼嫩部分、疏松易碎的愈伤组织或悬浮培养的细胞是制备原生质体的理想材料

①酶解材料的准备 ②材料的预处理 ③酶解 ④原生质体的纯化 ⑤原生质体活力的测定

原生质体活力的测定：

①目测法 ②二乙酸荧光素(FDA)法 ③酚藏红花染色法

植物细胞工程在食品工业中的应用

1、植物细胞培养 2、植物原生质体培养和细胞融合

3、植物细胞染色体工程 4、其他植物细胞技术工程

5、植物细胞工程在食品工业的应用

蛋白质工程：是以蛋白质结构、功能研究为基础，运用生物化学、分子生物学、遗传工程的方法，借助计算机信息处理技术的支持，从改变或合成编码蛋白的基因入手，定向地改造天然蛋白质或设计全新的人工蛋白质分子，使之具有特定的结构、性质和功能，能更好地为人类服务的一种生物技术。

蛋白质工程的基本研究内容：①从预期的蛋白质功能出发 ②设计预期的蛋白质结构

③推测应用的氨基酸序列 ④找到相应的脱氧核苷酸序列

蛋白质的研究内容：是以蛋白质结构和功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计把蛋白质改造为有预期的新特征的突变蛋白质，在基因水平上对蛋白质进行改造

按改造的规模和程度可以分为：初级改造、高级改造、从头设计合成新型蛋白质。

初级改造：个别氨基酸的改变和一整段氨基酸序列的删除、置换或插入。

蛋白质工程研究中主要采用的基因突变方法包括：基因定位突变、盒式突变

含有单一或少数几个突变位点的基因定向改变可以采用：

①M13-DNA寡聚核苷酸介导诱变技术 ②寡核苷酸介导的PCR诱变技术 ③随机诱变技术 ④盒式突变技术

高级改造：蛋白质分子的剪裁，如结构域的拼接

蛋白质工程在食品工业中的应用：

1、提高蛋白质和酶的热稳定性 2、改良蛋白质或酶的pH稳定性

3、改良蛋白质的氧化稳定性 4、提高酶的催化活性

5、修饰酶的催化特异性 6、修饰Nisin的生物防腐效应