中国石油天然气股份有限公司

油藏本源菌常规检测推荐方法

二零零七年六月

1. 主题内容与适用范围

本方法的目的是对油田油藏中的本源微生物进行普查，为在油藏中进行的微生物提高采收率作业提供判断与依据。

本标准规定了油藏中本源微生物分析的术语、方法原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、细菌记数方法、精密度和分析结果。
　　本标准适用于油藏中腐生菌TGB、烃氧化菌HOB、硝酸盐还原菌NRB、厌氧发酵菌FMB、硫酸盐还原菌SRB、产甲烷菌MPB的分析。油藏中其它本源菌的分析可参照执行。

2. 参照标准

SY/T0532—93 油田注入水细菌分析方法 绝迹稀释法

GB 4789.28 食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂

3. 术语

干热灭菌：将待灭菌的物品放入烘箱中，逐渐升温至140-160℃，维持2-3h，达到灭菌的目的。

湿热灭菌：将培养基和其它不宜干热灭菌的物品放入高压灭菌锅中，加热，使锅内蒸汽压达0.1MPa，持续20-30min，达到灭菌的目的。

4. 测试原理

绝迹稀释法：将待测水样按固定比例逐级注入到测试瓶或试管中进行接种稀释，直到最后一个测试瓶或试管中无菌生长为止，然后根据细菌生长情况和稀释倍数，计算出水样中细菌的数目。

5. 试剂和材料

a 化学试剂（均为分析纯）：乳酸钠、氯化钠、氢氧化钠、硫酸钠酚红、硫酸亚铁铵、硝酸铵、氯化铵、柠檬酸铁铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、尿素、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸镁等。

b 生物试剂：牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、酵母粉等。

c 维生素：烟酸、核黄素、叶酸、VB12、盐酸吡哆醇、D-泛酸钙、生物素、硫胺素等。

d 材料：纱布、脱脂棉、牛皮纸、线绳、6号针头等。

6. 仪器和设备

a 电热恒温培养箱：使用温度30~60℃±1℃；

b 电热鼓风干燥箱：使用温度30~300℃±5℃；

c 高压灭菌锅;

d 托盘天平:最大称量100g,感量0.1g;

e 冰箱;

f 酸度计:刻度为0.1ph单位;

g 电炉:1000~2000W;

h 烧杯:100,500,1000ml;

i 三角瓶:500,1000 ml;

j 量筒:250,500 ml;

k 试管:150mm×15mm若干个;

l 移液管:1 ml;

m 酒精灯;

n 注射器:1 ml;

o 细口瓶:125 ml;

p 显微镜　　　

q 水浴
　 r 吸管：1mL，10mL。
　　s 试管。
　　t 平皿。
　 u 接种环或接种针

w 厌氧培养装置

x 腐生菌测试瓶、烃氧化菌测试瓶、厌氧发酵菌测试瓶、硫酸盐还原菌测试瓶、产甲烷菌测试瓶。

7. 采样

采集的水样应具有代表性。

取样前，取样容器必须灭菌，推荐使用湿热灭菌。

取样前的准备：取样人穿戴好工作服、手套、防护眼镜，带上酒精棉球、棉纱、卫生纸、记录本和记号笔等。与油井管理人员联系，取得许可后进入井区。

油水井检查：观查井生产情况，检查管道和各阀门的工作状态，需要倒工作流程的，应要求当班工人倒流程。对于掺水生产井，先关闭掺水阀门，正常生产5分钟后再取样；对于含气量高的井，必须先进行放气处理，放气前要打开气体报警器，同时打开窗户，使空气流通。

取样：在正常生产的情况下，在井口或集输小站分离器前的取样口进行取样。取样时，将取样阀打开，使水以5~61/min的流速畅流3min后，再用水样洗涮容器三遍，然后接取样品。

样品装满后立刻加塞塞紧，盖上盖子，随即帖上标签，注明取样日期、时间、地点、取样条件及取样人、样品数等，并将相关信息同时记录在取样记录本上面。同一样品最好取2-3个，以便进行对比和平行样分析，也便于进行水化学的分析。

清洁现场：取样结束后，要对取样现场进行清洁处理，经油井管理人员验收合格后离开现场。

样品保藏和运输：运输过程中避免曝晒或霜冻。如取样现场距离分析检测地较远，应将样品在低温保藏箱中保藏。建议取样后尽快进行分析，如不能立即分析，样品取回后保存于6℃冰箱中，从取样到检测样品最好不超过24小时。

8. 样品的预处理

对含砂、泥等杂质样品分析前应静置；含油样品分析烃氧化菌时，应用无菌棉过滤除油；分析严格厌氧的产甲烷菌时，样品应在无氧条件下取样。

9. 分析步骤

在六类菌的分析中，推荐次序为先厌氧后耗氧。通常按“产甲烷菌MPB - 硫酸盐还原菌SRB - 厌氧发酵菌FMB - 烃氧化菌HOB - 腐生菌TGB - 硝酸盐还原菌NRB”的次序。

分析过程中推荐使用油藏平均温度和35℃两个温度，35℃的数据便于不同油藏温度区块的对比。

9.1 商品液体测试瓶法

部分培养基有商品测试瓶出售，如北京华兴化学试剂厂生产的硫酸盐还原菌、腐生菌等，可用此方法分析。

9.1.1估计水样中细菌的量，将数个装有相应菌类培养基的测试瓶排成一组并依次编上序号。

9.1.2 用75%的酒精溶液消毒操作者的手及测试瓶顶盖。

9.1.3 用无菌注射器吸取1ml水样注入到1号瓶内，摇匀。

9.1.4 另取一只无菌注射器，从1号瓶中吸取1ml液体注入到2号瓶中，摇匀。

9.1.5 重复上述操作程序，根据含菌量多少稀释到最后所需浓度。

9.1.6 放入恒温箱中培养。

9.1.7 腐生菌培养7d，测试瓶中液体由红色变为黄色或浑浊，即表示有腐生菌生长。

硫酸盐还原菌培养14－21d，测试瓶中液体变为黑色，即表示有硫酸盐还原菌生长。

9.2 自制液体测试瓶/液体试管法

在分析中，测试瓶和试管可互换通用，但要注意分析厌氧的硝酸盐还原菌NRB、厌氧发酵菌FMB、硫酸盐还原菌SRB、产甲烷菌MPB这四类菌时应选用厌氧试管。

9.2.1 产甲烷菌的分析

培养基的成分：

表1 产甲烷菌培养基（g/L）

实验步骤：

1） 无氧无菌储液的制备：先用煮沸除氧、通高纯N2至冷却的蒸馏水作为配剂水。配制以下溶液：

0.1%刃天青。

1% Na2S和10% NaHCO3的溶液，配制过程中继续通入高纯N2，最好压盖后能保持2个大气压。

微量元素浓缩液（配方见表2）：先将4.5克N(CH3COOH)3溶于90ml含NaOH1.8克的水溶液中，再加入其它药品，定容至100ml。

表2：厌氧用微量元素溶液成分（g/100ml）

# N(CH3COOH)3先溶于碱。避光保存

复合维生素浓缩液（配方见表3）。

表3 复合维生素浓缩液成分（mg/100ml）

# 存于冰箱，避光保存。

2） 培养基的制备：采用煮沸除氧

根据需要按表1比例逐一加入除Na2S、NaHCO3和半胱氨酸盐外的试剂，调PH为7.0左右，把培养基装入锥形瓶中，划一刻度，另加适量蒸馏水（1L培养基约加200ml蒸馏水），煮沸至原刻度；

通入无氧N2去除气相中的空气；停止加热10分钟左右加入半胱氨酸盐，注意继续通入无氧N210分钟，此时培养基颜色由兰紫色逐渐褪成浅粉色；在厌氧箱内或高纯N2保护下在厌氧箱外分装培养基。为便于10倍系列稀释，每只测试瓶9ml培养基，为避免漏气，用新的异丁橡胶塞塞紧后加压铝盖。

3） 灭菌

将培养基、1% Na2S和10% NaHCO3的溶液、2ml注射器、针头等物品在0.1MPa（121℃）下灭菌20~30分钟。

4） 测试方法

调试好厌氧箱并将所需无菌用品移入厌氧箱；对灭菌后的测试瓶进行编号，根据不同样品来源估计菌数，确定最高稀释度；每管培养基用无菌注射器加入0.2ml1% Na2S和0.1ml10% NaHCO3。用经无氧氮气置换的灭菌注射器从预处理后的样品中抽取1.0ml样品做10倍系列稀释接种，并通入H2/CO2 为80:20的混合气。每一组均应留一不接种的空白作对照。

测试瓶的稀释接种见附录A：测试瓶法测细菌总数

5） 培养方法

产甲烷菌在培养箱内恒温倒置培养，一般温度为平均油藏温度和35℃，如果有特殊需要可视具体情况而定。

6） 阳性管的检出

阳性管，即有待测菌生长的稀释管。培养2~3周后，用气相色谱测定各稀释管中甲烷的含量，以判定产甲烷菌是否生长，检出阳性管。

7） 菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.2 厌氧发酵菌的分析

培养基的成分：

表4 厌氧发酵菌培养基

# 适用温度为< 90 ℃

实验步骤：

1） 培养基的制备

按表4配制培养基，再用1NNaOH或HCl调PH。

发酵菌培养基应先煮沸除氧：在培养基中加适量蒸馏水（1L培养基约加200m蒸馏水），煮沸至原体积时停止加热，立刻通入高纯N2气10~20分钟，然后可在厌氧箱中或厌氧箱外氮气保护下分装。每瓶分装9ml培养基，用压盖器压上铝盖。在厌氧箱外分装时，气针需插入测试瓶中，通高纯N2弱气流（对脸能感觉即可），培养基冒泡数秒后，拔针同时塞紧胶塞。

2） 灭菌

将这些物品及1ml注射器、针头在0.056MPa（112℃）下灭菌25分钟。

3） 测试方法

测试可用单组或多组测试瓶，有条件的实验室最好在无菌间操作。将测试瓶编号，每组留一瓶空白培养基作对照，编号为“0”，具体操作见附录A：细菌测试瓶法。

4） 培养方法

接种后，放入培养箱中培养，14天后以培养基的混浊判断厌氧菌的存在。特别注意观察测试瓶底部，厌氧菌在底部生长较多。如空白样有菌生长，应重做。

5） 菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.3 硫酸盐还原菌（SRB）的分析

培养基配方见表5。

表5 硫酸盐还原菌培养基

实验步骤：

1） 培养基的制备

配1%的EDTA溶液：按100ml蒸馏水中溶1.000g乙二胺四乙酸二钠的比例配制所需体积溶液。

按上表比例配制所需培养基，将上述试剂除Mohr氏盐以外的成分用蒸馏水逐一溶解，然后装入烧杯中，加Mohr氏盐后用10%NaOH溶液调培养基PH至8.2-8.4。

2） 分装、灭菌

快速将培养基分装到测试瓶中，每瓶9ml培养基，用压盖器压上铝盖。

将培养基及1ml注射器、针头在121℃下灭菌20分钟。

3） 测试方法

测试可用单组或多组测试瓶，有条件的实验室最好在无菌间操作。将测试瓶编号，每组留一瓶空白培养基作对照，编号为“0”，具体操作见附录A：细菌测试瓶法。

4） 培养方法

接种后，放入培养箱中培养。14天后观察，瓶内液体变黑，即表示有硫酸盐还原菌生长。如空白样有菌生长，则应重做。

5） 菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.4 烃氧化菌（HOB）的分析

培养基的成分：

表6、 烃氧化菌培养基

佘老师说效果不明显可加点1‰酵母粉，张浩说可加万分之一-3‰。

表7 微量元素浓缩液成分（mg/100ml）

#存于冰箱，避光保存。

实验步骤：

1） 培养基的制备

为便于称量，先将微量元素（加量见表7）、复合维生素（加量见表4）制成100ml的10倍浓缩液，存于冰箱内备用。

红色液蜡的配制：按100ml石蜡中加油溶红1mg的比例配制含0.001%油溶红的石蜡，若有沉淀，用脱脂棉过滤待用。

将表6中除液蜡外的成分逐一溶解并加入微量元素、复合维生素溶液，再用10%NaOH或HCl调PH，然后分装入测试瓶中，每瓶9ml，再加1.0ml含0.001%油溶红液蜡，用压盖器压盖密封。

2） 灭菌

将培养基及2ml注射器、针头湿热灭菌20~30分钟。

3） 测试方法

测试可用单组或多组测试瓶，有条件的实验室最好在无菌间操作。将测试瓶编号，每组留一瓶空白培养基作对照，编号为“0”，具体操作见附录A：细菌测试瓶法。

注意：取样时应注意除油，因为油溶于石蜡后影响实验结果。

4） 培养方法

接种后，放入相应温度的、100rpm摇床中培养。通常培养14天后. 可观察结果。

烃氧化菌以油水界面存在的菌膜或液蜡乳化结合镜检来判断细菌的生长，运动性强的细菌也可表现为培养基混浊。如空白样有菌生长，则应重做。

5） 菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.5 腐生菌（TGB，异氧菌）的培养基及分析方法

培养基的成分：

表8 腐生菌培养基

* 表中氯化钠含量应与油藏盐度一致，其值可根据油藏环境调整。

* 适用温度为≤85℃

实验步骤：

1）培养基的制备

（1）、100mL0.2%苯酚红指示剂的配制

a、配制50mL0.05mol/L的NaOH溶液：称取0.1000gNaoH（分析纯）溶于50mL蒸馏水中。

b、称取0.2000g的苯酚红（分析纯）。

c、把称好的苯酚红放于烧杯中，逐滴加入0.05mol/L的NaoH溶液，同时不断地搅拌，直至完全溶解。大约14.15mL0.05mol/L的NaoH溶液即能将0.2000g苯酚红完全溶解。（理论值为11.4ml）。

d、将完全溶解的苯酚红中加入100ml容量瓶中，定容至100ml。摇匀后转移至棕色滴瓶中。

（2）、配制培养基

按表1比例，将培养基中成分逐一溶解，并用10%NNaOH或HCl调PH，然后分装入试瓶中，每管9ml，用压盖器压盖密封。

2）灭菌

将培养基及2ml注射器、针头湿热灭菌20~30分钟。

3）测试方法

测试采用绝迹稀释法，可用单组或多组测试瓶，有条件的实验室最好在无菌间操作。将测试瓶编号，每组留一空白培养基作对照，编号为“0”，具体操作见附录A：细菌测试瓶法。

4）培养方法

将测试瓶放在培养箱内培养，7天后观察，瓶内液体变色或呈现混浊，即表示有腐生菌生长。高温时，空白培养基会变色，则以液体的混浊判断腐生菌的生长。如空白样有菌生长，应重做。

5）菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

9.2.6 硝酸盐还原菌的分析

有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

培养基的成分：

实验需用以下三种溶液。

表9 硝酸盐（Nitrate）培养基

表10 格里斯氏Griess试剂

二苯胺试剂：0.5g二苯胺溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。

实验步骤：

1） 培养基的制备：

用蒸馏水少量、多次清洗实验用瓶、塞、注射器。特别注意清洗时要每瓶、每只注射器分开清洗，不要互相混洗。

硝酸盐培养基：将培养基按表10比例放于蒸馏水中加热溶解，调pH至7.4，滤纸过滤，分装测试瓶，每瓶9ml，盖胶塞，不加铝盖，放入白瓷盘中。在上述培养基中加入硫乙醇酸钠0.18即成厌氧菌用的硝酸盐培养基。

A液: 在通风柜中先用对氨基苯磺酸0.5g溶解于10%乙酸溶液50mL中，微加热溶解，再加至10%乙酸溶液至150mL。放人带玻璃塞的玻璃瓶中4～10℃保存。

B液:,在通风柜中先用将甲基萘胺0.1g，溶解于10%乙酸溶液150mL，稍加热溶解，用20ml蒸馏水稀释，用脱脂棉过滤，放棕色瓶中，4～10℃保存。

二苯胺试剂：0.5g二苯胺溶于100ml浓硫酸中，缓慢用20ml蒸馏水稀释。

2） 灭菌

将装硝酸盐培养基的白瓷盘加瓷盘盖依次重叠。在121℃高压蒸汽灭菌20min。

3） 测试方法

做样前抽检培养基、注射器：随机取灭菌培养基2-3瓶，用注射器取样后加入A、B液，若显阴性，则表示合格，否则，应分析原因，重新配培养基或处理注射器。

测试可用单组或多组硝酸盐培养基测试瓶。将测试瓶编号，每组留一瓶空白培养基作对照，编号为“0”，具体操作见附录A：细菌测试瓶法。

4） 培养、观察方法

将接种后的培养瓶在培养箱中培养，于18-24小时内、3天、5天取样测定， 对阴性反应菌株要连续观察。取比色

瓷盘小窝，分别在小窝中加入不同稀释瓶的培养液数滴，第一个小窝加空白培养基以对照。再加试剂A和B各1滴，立刻或数分钟内显红色、橙色、棕色等颜色，表示硝酸盐还原为亚硝酸盐，即为阳性；若无色，可再加入1-2滴二苯胺试剂，若呈兰色，表示培养液中仍有硝酸盐，无硝酸盐还原作用，是真正的阴性；如不呈兰色，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已继续还原成其它物质（如N2，NH3），仍表示硝酸盐还原阳性。

用α-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后应立即判定结果。α-萘胺具有致癌性、故使用时应加注意。

5） 菌浓的计算

菌浓的计算方法见附录B。

10. 细菌计数方法

细菌计数方法按附录B执行。

11. 精密度

同一操作者，在同一实验室按本方法规定的步骤，在连续时间内，对同一样品进行重复测定，如样品细菌含量高，所得结果允许误差不得大于102，如样品浓度低，所得结果允许误差不得大于101。

12. 分析结果

根据需要给出细菌含量范围或准确的细菌计数,个/ml。

附 录 A

测试瓶法测细菌总数

测试步骤：

1、 估计水样中的菌数，将数个灭菌测试瓶排成一组，并依次编上序号；

2、 用小刀去除铝盖中心部分，用酒精棉球消毒胶塞；

3、 用无菌注射器把1ml水样注入1号瓶中，充分振荡；

4、 同样去除铝盖中心部分，用酒精棉球消毒胶塞，另取一只无菌注射器从一号瓶内取1ml水样注入2号瓶中，充分振荡；

5、 重复上述操作程序，直到最后一瓶。

附 录 B

细菌计数方法

（补充件）

B1 一个试样单组测试瓶（管）细菌计数法

测细菌含量范围，宜用一个试样做五个稀释度，按稀释度的大小依次排列。如1号瓶（管）有细菌生长，其余4个瓶（管）无菌生长，表明细菌含量范围为1—10个/ml。若2号瓶（管）有细菌生长，则细菌含量范围为10—102个/ml。以此类推，细菌含量范围计数见表B1。

表B1 单组细菌计数表

B2 一个试样多组测试瓶（管）细菌计数法

为较准确的测出细菌数量，应采用两管法、三管法，四管法或五管法。两管法是指每个水样、每个稀释倍数做两个平行；三管法是指每个水样，每个稀释倍数做三个平行试验；四管法是指每个水样、每个稀释倍数做四个平行试验；以此类推，水样应稀释到最高稀释度不长菌为宜。

B2.1 细菌计数方法举例1：用两管法分析某水样腐生菌含量，见表B2

表 B2

选相邻三个稀释倍数中有菌生长的管数，得指数为“221”、查表B6细菌数为70个/ml，再乘以第一位上的稀释倍数101，即得水样中腐生菌含量为7.0×102个/ml。

B2.2 细菌计数方法举例1：用三管法分析某水样腐生菌含量，见表B3。

表 B3

选相邻三个稀释倍数中有菌生长的管数，得指数为“332”、查表B7细菌数为110个/ml，再乘以第一位上的稀释倍数101，即得水样中腐生菌含量为1.1×103个/ml。

B2.3 细菌计数方法举例2：用四管法分析某水样腐生菌含量，，见表B4。

表 B4

选相邻三个稀释倍数中有菌生长的管数，得指数为“321”、查表B8细菌数为3.0个/ml，再乘以第一位上的稀释倍数103，即得水样中腐生菌含量为3.0×103个/ml。

B2.4 细菌计数方法举例3：用五管法分析某水样腐生菌含量，见表B5。

表 B5

选相邻三个稀释倍数中有菌生长的管数，得指数为“531”、查表B9细菌数为11.0个/ml，再乘以第一位上的稀释倍数103，即得水样中腐生菌含量为1.1×104个/ml。

计算方法用公式表示：

1ml水样中的菌数=菌数个/ml×指数第一位数上的稀释倍数

B2.5 稀释法测数统计表见表B6—B8。

表B6 两个平行管最大可能的菌数

表B7 三个平行管最大可能的菌数

表B8 四个平行管最大可能的菌数

表B9 五个平行管最大可能的菌数

参考文献：

1. 农业部厌氧微生物开放实验室，《产甲烷细菌及研究方法》，成都科技大学出版社，1997年。

2. 中石化胜利油田，“十五”课题中评估，《胜利油田极端微生物石油开采技术研究》，2002年

3. SY/T0532—93，油田注入水细菌分析方法 绝迹分析法。

4. 戚厚发等著，《中国生物气成藏条件》，石油工业出版社，1997年，P3—4。

5. 钱存柔等, 《微生物学实验教程》，北京大学出版社,1999.

东秀珠等，科学出版社，《常见细菌鉴定手册》2001
附加说明：
本标准由中国石油天然气股份有限公司提出。
本标准由中国石油天然气股份有限公司勘探开发研究院廊坊分院石油微生物实验中心负责起草。
本标准主要起草人 吴庆红
本标准由廊坊分院石油微生物实验中心负责解释。