聪明文档网
最新最全的文档下载
当前位置：
首页> 正在进行安全检测...
正在进行安全检测...
时间：2023-11-19 02:59:21 下载该word文档
分子生物学实验
实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析
一、实验目的
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
二、实验原理
提取原理：CTAB能溶解细胞膜，在高离子强度下，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行冷冻，研磨、破碎细胞后加入CTAB，将DNA溶解出，用酚、氯仿去除蛋白，经乙醇沉淀得到DNA。
定性原理：琼脂糖凝胶电泳是把DNA样品加入到含电解质的琼脂糖凝胶的样品孔中，置静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。若是DNA分子，在点样孔对应的正极端可观察到透明条带。
定量原理：DNA或RNA在260nm波长处有紫外吸收峰，吸收强度与核酸浓度成正比。紫外分光光度法还可通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值的比值估计核酸的纯度。
三、实验步骤
I．提取步骤
1.将100mg液氮冷冻条件下的拟南芥嫩叶在1.5mlEP管内研磨成粉末状。2.加0.6ml2×CTAB液，混匀，65℃水浴30min，每10min颠倒混匀一次。3.取出离心管，冷却后加入0.6ml酚氯仿混合液，混匀。
4.11,500rpm室温离心8min。取400μl上清液到一新的1.5ml离心管中。5.加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500rpm离心8min，取350ul上清。6.加入600μl无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min。7.4℃，15,800rpm离心20min，弃上清。
8.1ml70％乙醇(预冷洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能Vertex，7,000rpm离心3min，弃上清，风干(超清台操作。
9.加入30μl无菌水(含20μg/mlRNaseA，37℃下溶解DNA30min。10.在一PCR管加5μlDNA样品和1μl6×loadingbuffer，混匀，电泳备用。II．定性步骤——琼脂糖凝胶电泳
1.制胶
①0.3g琼脂糖和40mlTBE缓冲液混合，微波加热至熔化，制0.75％琼脂糖凝胶液。
-1-
分子生物学实验
②将内槽放置于水平位置，并在固定位置放好样品梳子。
③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入核酸染料1.5μl，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至板上形成一层均匀的胶面。
④室温静置到凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，将凝胶及内槽放入电泳槽中。2.加样
用10μl微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNAmarker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头。
3.电泳
①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极向正极移动。最高电压不超过5V/cm。②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的条带，采用凝胶成像系统拍照保存。III．定量步骤——紫外分光光度法
(1取1μl样品和19μlddH2O于1.5ml的离心管中混匀，备用。
(2开机，调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击‘setref