实验1-3 蛋白质的定量测定（Folin-酚试剂法）

一、实验原理

1921年，Folin 首创Folin-酚试剂法，利用蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷钼酸）起蓝色反应；1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。Folin-酚试剂法主要包括两步：

第一步 双缩脲反应

在碱性溶液中，双缩脲（H2NOC－NH－CONH2）能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物，这个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩脲反应。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。

第二步 Folin-酚显色反应

Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。由于蛋白质中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显色反应。即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。

在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出样品中蛋白质的含量。另外，可以根据预先绘制的标准曲线求出待测样品中蛋白质的含量。

二、实验材料

（一）样品

健康人血清（稀释300倍）

（二）试剂

1．牛血清白蛋白标准液（200g/ml）

准确称取牛血清白蛋白粉末50.0mg，用0.1mol/L NaOH溶液润湿溶解，加蒸馏水到250ml。

2．碱性硫酸铜溶液

①碱溶液：Na2CO3 2g 溶于100ml 0.1mol/L NaOH中。

②硫酸铜溶液：CuSO4∙5H2O 0.5g溶于100ml 35mmol/L(1%)酒石酸钾钠中。

使用前将①与②按50:1混合即成碱性硫酸铜溶液。使用时新鲜配制。

3．Folin-酚试剂

在2L磨口回流装置内加钨酸钠（Na2WO4∙2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4∙2H2O）25g，蒸馏水700ml，14.68mol/L（85%）磷酸50ml，浓盐酸100ml，充分混合后用小火回流10h。冷却后，再加硫酸锂（Li2SO4∙H2O）150g，水50ml，数滴（2~3滴）液体溴（也可用30%H2O2 6~8滴代替），然后开口沸腾15min，驱除过量的溴（因溴气甚毒，这一步应在通风橱中进行），冷却后加水至1000ml，过滤，溶液呈黄色（如带绿色则不能用），保存于棕色瓶中置冷暗处备用（如配制时间较长，试剂转呈绿色），可再加液体溴数滴，煮沸15min，若能恢复原有的黄色或金黄色仍可继续使用）。

（三）仪器及器材

1．V-1100分光光度计

2．恒温水浴箱

3．试管6支、试管架

4．加样枪、加样枪架

5．坐标纸

三、实验步骤

（一）操作步骤

（二）注意事项

1．干扰物质

此法是在Folin-酚法的基础上引入双缩脲试剂，因此凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性质上是氨基酸或肽的缓冲剂，如Tris缓冲剂以及蔗糖，硫酸铵，巯基化合物均可干扰Folin-酚反应。此外，所测的蛋白质样品中，若含有酚类及柠檬酸，均对此反应有干扰作用。而浓度较低的尿素（约0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸钠（1%），硝酸钠（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）对显色无影响，这些物质在所测样品中含量较高时，则需做校正曲线。若所测的样品中含硫酸铵，则需增加碳酸钠—氢氧化钠浓度即可显色测定。若样品酸度较高，也需提高碳酸钠—氢氧化钠浓度1—2倍，这样即可纠正显色后色浅的弊病。

2．控制时间

因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间。即第1支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入2.0ml碱性硫酸铜试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。全部试管加完碱性硫酸铜试剂后若已到10分钟，则第1支试管可立即加入0.20ml Folin-酚试剂，1分钟后第2支试管加入0.20ml Folin-酚试剂，2分钟后加第3支试管，以此类推。40℃水浴10min，冷却后，每一分钟测定一管吸光值。

四、结果与讨论

（一）结果

1．数据记录

按照下表记录各管在500nm波长测得的吸光度值。

2．绘制标准曲线

（1）选择合适的坐标纸

（2）画坐标轴：以A500值为纵坐标，牛血清清蛋白标准液浓度为横坐标。

（3）根据测得的数据描点

（4）连线：根据所描点的分布情况，作过原点的直线或光滑连续的曲线，该线表示实验点的平均变动情况，因此该线不需全部通过各点，但应尽量使未经过线上的实验点均匀分布在曲线或直线两侧。

（5） 求实验结果

3．结果计算

根据未知样品溶液的吸光度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。然后乘以稀释倍数（300），得出每毫升未稀释血清含蛋白质的微克数，即每毫升血清中蛋白质的微克数(g/ml)。

血清蛋白浓度(g/ml) = 样品蛋白质浓度×2×300

参考：正常人血清蛋白浓度范围为60~80 g/L。

4．常见问题及处理