遗传图谱

通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分裂的重组频率为1%)来表示。绘制遗传连锁图的方法有很多，但是在DNA多态性技术未开发时，鉴定的连锁图很少，随着DNA多态性的开发，使得可利用的遗传标志数目迅速扩增。早期使用的多态性标志有RFLP(限制性酶切片段长度多态性)、RAPD(随机引物扩增多态性DNA)、AFLP(扩增片段长度多态性)；80年代后出现的有STR(短串联重复序列，又称微卫星)DNA遗传多态性分析和90年代发展的SNP(单个核苷酸的多态性)分析。

物理图谱

物理图谱是利用限制性内切酶将染色体切成片段，再根据重叠序列确定片段间连接顺序，以及遗传标志之间物理距离［碱基对(bp)　或千碱基(kb)或兆碱基(Mb)］的图谱。以人类基因组物理图谱为例，它包括两层含义，一是获得分布于整个基因组30 000个序列标志位点(STS，其定义是染色体定位明确且可用PCR扩增的单拷贝序列)。将获得的目的基因的cDNA克隆，进行测序，确定两端的cDNA序列，约200bp，设计合成引物，并分别利用cDNA和基因组DNA作模板扩增；比较并纯化特异带；利用STS制备放射性探针与基因组进行原位杂交，使每隔100kb就有一个标志；二是在此基础上构建覆盖每条染色体的大片段：首先是构建数百kb的YAC(酵母人工染色体)，对YAC进行作图，得到重叠的YAC连续克隆系，被称为低精度物理作图，然后在几十个kb的DNA片段水平上进行，将YAC随机切割后装入粘粒的作图称为高精度物理作图.

　　因限制性内切酶在DNA链上的切口是以特异序列为基础的,核苷酸序列不同的DNA,经酶切后就会产生不同长度的DNA片段,由此而构成独特的酶切图谱。因此，DNA物理图谱是DNA分子结构的特征之一。DNA是很大的分子,由限制酶产生的用于测序反应的DNA片段只是其中的极小部分,这些片段在DNA链中所处的位置关系是应该首先解决的问题,故DNA物理图谱是顺序测定的基础,也可理解为指导DNA测序的蓝图。广义地说,DNA测序从物理图谱制作开始,它是测序工作的第一步。制作DNA物理图谱的方法有多种,这里选择一种常用的简便方法──标记片段的部分酶解法,来说明图谱制作原理。

    用部分酶解法测定DNA物理图谱包括两个基本步骤:

　　(1)完全降解：选择合适的限制性内切酶将待测DNA链(已经标记放射性同位素)完全降解,降解产物经凝胶电泳分离后进行自显影,获得的图谱即为组成该DNA链的酶切片段的数目和大小。

　　(2)部分降解：以末端标记使待测DNA的一条链带上示踪同位素,然后用上述相同酶部分降解该DNA链,即通过控制反应条件使DNA链上该酶的切口随机断裂,而避免所有切口断裂的完全降解发生。部分酶解产物同样进行电泳分离及自显影。比较上述二步的自显影图谱,根据片段大小及彼此间的差异即可排出酶切片段在DNA链上的位置。下面是测定某组蛋白基因DNA物理图谱的详细说明。

　　该基因全长5900bp,用限制酶HpaⅡ完全降解该DNA可产生五个大小不等的片段,电泳分离并参照已知分子量的标准DNA带,得知这些片段的大小分别为1930、1690、1020、950和310bp。不难推测该DNA上有四个HpaⅡ切口,但切口的位置和这五个片段在完整基因中的排列顺序此时尚无法知道。接着将末端标记的该DNA片段进行HpaⅡ的部分降解,由于各切口随机断裂,产生的片段数显然会多于完全降解产物。但电泳后的自显影图上只可能出现末端标记的DNA片段。若以待测DNA在左端为标记处,那么自显影图上将呈现4210、3260、2950和1020bp四条带。其中最小片段（1020bp）与完全降解产物为同一片段，它应定位于该基因的左端；而最大片段（4210bp）与完整基因（5900bp）之差的片段（1690bp）无疑应定位于该基因的右端；余下的三个片段（1930、930和310bp）的定位，根据部分酶解的相邻片段之差很易确定。据此推出的这五个片段在该基因上的排列顺序是（左→右）:1020-1930-310-950-1690。物理图谱与DNA测序的原理颇为相似，二者是通过片段长度来推测位置，所不同的是测序确定核苷酸（碱基）的位置，而此处是确定某个片段的位置。DNA物理图谱测定后,便可对每一酶切片段进行核苷酸顺序分析。在测定了所有片段的DNA顺序后,根据物理图谱将各片段"拼凑"起来就得出了待测DNA链的全部核苷酸顺序。基因的全顺序测定才是我们要达到目的,一般人类基因的长度都在10Kb以上,巨大基因可长达200Kb,要完成基因的全顺序测定需进行大量的工作。完成这些工作可采取多种不同的方法,但其基本思路是一致的,即在确定物理图谱的基础上,再进行DNA顺序测定。 

物理图谱的类型

物理图谱有许多结构和形式。限制性图谱（restriction map），用于对小区域、如kb量级做精细结构制图，细胞遗传学图（cytogenetic map），用于对以104 kb为长度量级的区域制图。最常用的两种类型是STS含量图（STS content map）和放射性杂交图（radiation hybrid map），它们的分辨区域都大于1Mb，并且有能使用简易PCR中的定位标记物的优点。

在STS含量图中，STS标记物通过多聚酶链反应所监测，在反应中它与一个大的插入克隆基因库反应，如酵母人工染色体（TACs），细菌人工染色体（BACs）和粘粒等。如果两个或多个STS被发现是存在于同一个克隆之中，那么这些标记位点紧密相邻的机会就很高（不是100%，因为在制图过程中存在一些假象，如出现嵌合克隆体）。一段时期以来，根据STS含量图已经建立起一系列重叠群，如含有STS的重叠簇克隆。这样一张图的分辨率和覆盖度由一些因子决定，如STS的密度、克隆群体的大小、以及克隆文库的深度。通常STS含量图以长1Mb的插入YAC库为基础，分辨率为几百个bp。如果使用插入部分较小的克隆载体，图谱就会有一个更高的理论分辨率，但是覆盖基因组同样大小面积就需要更多的STS。虽然一般有可能从STS含量图上得到标记物的相对顺序，但是相邻标记物之间的距离还是无法精确测得。尽管如此，STS含量图还是有与克隆原相关的优点，并且可将其用于更进一步的研究，如次级克隆或DNA测序。到目前为止，STS含量图制图简单而使用最多的来源是巴黎的CEPH（centre d Etudes du Polymorphisme Humain）中的YAC库。它是一个10×覆盖率的文库，平均插入长度为~1Mb。

放射性杂交图（对片段DNA的断点作图。在此技术中，一个人体细胞系被致死性的gamma射线照射，染色体DNA分成片段。然后该细胞系与一个仓鼠细胞系融合而被救，并能繁殖几代。在这期间，人类细胞和仓鼠细胞的杂合体随机丢失其人类染色体片段。这样一百个或更多的杂合细胞系克隆体中，每一个都有不同数量的染色体片段，筛选生长后，就可以形成一套杂合组，供接下来的制图实验用了。

如果要在一个放射性杂交组中对一个STS作图，那就要将每种杂交组细胞系中的DNA进行STS的PCR操作。细胞系中如果含有该STS的染色体片段，那么就能得到一个正的PCR信号。在基因组中相邻很近的STS有相似的固位模式（retention pattern），因为放射性引起的断点落在它们中间的几率很小。相邻较远的STS固位模式相似性降低，相邻很远的STS的固位模式将会截然不同。与基因图谱所用方法类似，算法类的软件也能推出STS在放射性杂交图上的相对顺序，并通过断点落在其中间的可能性，用某一距离系统计算相邻标记物之间的距离。放射性杂交图还能提供一个标记物位于某一个特殊位点的可能值（优势对数值）。一个放射性杂交图的分辨率依赖于杂交体片断的大小，而这又依赖于人体细胞系所受的辐射量。一般对基因组大小作图的细胞系分辨率为～1M。

除STS含量图和放射性杂交图外还有几个方法可用于制作人类物理图谱。克隆图谱使用与STS含量图不同的技术来决定克隆体的接近程度。例如，CEPH YAC图谱法综合利用指纹法（fingerprinting）、间－Alu产物杂交法（inter-Alu product hybridization）和STS含量图法来制作一张重叠的YAC克隆体图谱。缺失和体细胞杂交图依赖于大型基因组重组（可以人工引进或由实验本身引起），从而将标记物放在由染色体断点所限定的bin?中。FISH图谱使用一个荧光信号来探测克隆体的间期DNA扩散时的杂交情况，从而以细胞遗传学图中一条带的位置定出克隆体的位置。

研究者捕捉致病基因时对转录序列图谱有特别的兴趣。这些序列是由已表达序列，和那些从已转化成STS并置于传统物理图谱的已知基因衍生而来的。近来一些制作大量EST的工程已经使制图实验室能够得到数以万计的单一表达序列。一旦一个致病位点被鉴定出来后，这些转录序列图谱就能明显加快对目标基因的研究速度。

ESTs和物理图谱构建

ESTs在多种以基因为基础的人和植物基因组物理图谱构建中扮演着重要角色。在这一应用中，从ESTs发展起来的PCR或杂交分析可用来识别YACs、BACs或其他含有大片段插入克隆类型的载体，它们是构建基因组物理图谱的基础，将EST与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有剩余基因序列的基因组区间，包括调控基因表达的DNA控制元件，对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的详细了解。物理图谱与遗传图谱间的相互参考，形成一个用途更广泛的综合资源，获得这张综合图谱后，研究人员就可以孟德尔遗传特征为基础，将相关基因定位在基因组区间上，并且通过查询以ESTs为基础的苈图谱，即可获得这一区间上所有基因的名单。该综合资源用途的大小取决于EST数据库中拥有的基因数目。目前人和小鼠EST的不断扩充使其应用更加广泛和便捷。