E.Z.N.A. Stool DNA Kit 50T试剂盒，自己翻译，仅用于交流学习。

实验之前准备：1.5ml离心管×2；2ml离心管×1；无水乙醇；冰离心管盒；常温离心管座；制冰；Elution Buffer需60-70℃预热。

所需仪器：高速离心机；70℃水浴锅；漩涡振荡器；计时器；制冰机；称量器；移液枪1ml，200µL，20µL；100ml量筒。

实验步骤：

1、加 80 mL (96%-100%) 无水乙醇至DNA Wash Buffer中以稀释。

2、在2ml离心管（自备）中装200mg glass beads。冰上预冷。使用刮刀刮取样品50-100 mg。

3、样品融化之前迅速加300µL Buffer SP1，10µL Proteinase K solution到离心管中。漩涡最大速度震荡5min直至粪便样品完全均匀。

4、70℃孵育，过程中需要通过涡旋混匀两次。共孵育13min。革兰氏阳性菌需增加90℃，5min。

5、冰上孵育2min。

6、加100µL Buffer SP2。通过漩涡震荡30s使样品混合充分。

7、冰上孵育5min。

8、13000-20000g离心5min使粪便形成颗粒状。

9、仔细地吸取上表层到1.5ml 离心管中（自备），确保避开颗粒或碎片。

10、加200µL HTR至1.5ml离心管中，使用1ml移液器充分抽吸混匀，漩涡震荡10s。

10、室温孵化2min。

11、大于13000g离心2min，目的是使抑制剂吸收HTR成颗粒状。

12、吸取250µL上清至新的2ml管中。

13、加250µL BL Buffer，250µl 无水乙醇到溶解产物中。通过漩涡震荡10s充分混合样品。

14、将上步中的整体样本包括沉淀，加到DNA柱中套上2ml收集管（提供）。大于13000g室温离心1min。弃掉液体和底部收集管。

15、将柱子安装在新的2ml收集管中（提供），加入500µL HB Buffer。大于13000g离心1min。弃掉液体和收集管。

16、将柱子安装在新的2ml收集管中（提供）。加入750µl DNA Wash Buffer（稀释过的），大于13000g离心1min。弃掉液体，将柱子重新插入空的收集管中。

17、大于13000g室温离心2min，使柱子干燥。这步很关键，除去乙醇以免干扰之后的步骤。

18、将柱子套在一个新的1.5ml管中（自备）。Elution Buffer需60-70℃预热，加200µl 直接到柱子底部的基质上。室温下浸润2min。大于13000g离心1min。

DNA提取完成后：

检测DNA质量：双蒸水洗涤，TE缓冲液调零，取5µl DNA经过TE缓冲液稀释至1000µl，釆用紫外分光光度计分别检测总DNA在260nm和280nm两处的吸光度,得到总DNA的浓度和OD 260/OD280的比值,若该比值在1.6-1.8之间,说明样品的DNA的纯度较高,无蛋白质和RNA污染;若比值<1.6,说明有蛋白质污染;若比值在1.8-2.0之间,说明有RNA污染。

检测DNA纯度：琼脂糖凝胶电泳法。称取0.36g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入60ml TAE缓冲液，保鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透明取出摇匀，加EB，倒入槽凝固呈胶。DNA样品与buffer混匀后点样，跑胶，紫外灯下观察条带。