护骨胶囊对成骨细胞增殖、分化影响

李宝红1， 吴劲东2， 赵文昌1， 宋丽军1

(1.广东医学院药学院 广东 东莞523808；广东医学院药理学教研室，广东 东莞523808)

摘要：目的：探讨护骨胶囊对体外培养的大鼠成骨细胞增殖、分化的影响。方法：采用多次酶消化法分离出大鼠颅盖骨的成骨细胞,采用MTT法和碱性磷酸酶法分别检测护骨胶囊对成骨细胞增殖和分化的作用;采用SYBR green I嵌合的RT-PCR方法检测Runx2 mRNA表达水平。结果：护骨胶囊在浓度0.025~2.5μg/mL对成骨细胞有促增殖的作用,护骨胶囊在浓度0.025~25μg/mL对碱性磷酸酶的活性均有提高的作用,护骨胶囊在浓度25μg/mL下,对Runx2 mRNA水平有上调的作用。结论：护骨胶囊对成骨细胞有促增殖、促分化的作用,可能与上调Runx2 mRNA水平有关。

关键词：护骨胶囊；成骨细胞；碱性磷酸酶；Runx2

中图分类号：R283 文献标志码：A 文章编号：1673-842X（2013）10-0024-03

Effect of Capsule on Proliferation and Differentiation of Primary Osteoblasts in Vitro

LI Baohong,WU Jindong,ZHAO Wenchang,SONG Ljiun

(1.College of Pharmacy, Guangdong Medical College,Dongguan 523808,Guangdong China;

2.Department of Pharmacology, Guangdong Medical College,Dongguan523808 Guangdong,China)

Abstract:Objective:To investigate the effect of Hugu Capsule on proliferation and differentiation in primary osteoblasts.Methods:Bone cells were obtained by enzyme digestion from the segregated neonatal SD rat skull.The effects of Hugu Capsule on the proliferation and differentiation of rat osteoblasts were evaluated by the MTT method,measuring the avtivity ofalkaline phosphatase, respectively.Runx2 expression was analyzed by real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) using SYBA Green I. Results:With the concentration of 0.025-2.5μg/mL,Hugu Capsule had significant effect on theROB’s proliferation. The ALP activity was significantly increased at the concentration from 0.025μg/mL to 25μg/mL. With the concentration of 25μg/mL,Hugu Capsule can increase the Runx2 Mrna level.Conclusions:Hugu Capsule can stimulate the proliferation and differentiation of osteoblasts in vitro, and the reason may be connected with the up regulation of Runx2mRNA level.

Key words:Hugu Capsule; osteoblasts; alkaline phosphate;Runx2

护骨胶囊是由淫羊藿、制何首乌、巴戟天、骨碎补、龟甲、山药、熟地黄、当归、杜仲、续断等组成的中药复方新药，临床试验表明其具有较好的治疗原发性骨质疏松症和绝经后骨质疏松症的作用[1-2]。但目前对其抗骨质疏松的作用机制尚未进行深入研究，本项目通过探讨护骨胶囊对大鼠原代成骨细胞增殖分化的影响，并进而分析其调控骨形成过程中转录因子Runx2 mRNA的表达水平，为护骨胶囊治疗骨质疏松症提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

护骨胶囊干膏粉，由东莞万成制药有限公司提供，临用前用DMEM配制成所需药物浓度；新生SPF级大鼠，1ｄ龄，购自广东医学院实验动物中心，动物合格证号：SYXK（粤）2008-0008；DMEM培养基，Gibco公司；胎牛血清，hyclone公司；碱性磷酸酶试剂盒，由南京建成生物工程研究所提供；逆转录试剂盒和real time-PCR试剂盒，由大连Takara公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。

1.2 主要仪器

ABI 7500 Real Time PCR 扩增仪，美国ABI 公司；Nanodrop 1000 核酸蛋白微量定量仪，美国Nanodrop 公司；5417R型高速台式离心机，德国Eppendrorf 公司；微型离心机，德国Eppendorf 公司；PCR 扩增仪，美国Applied Biosystems 公司；酶标仪，美国BioTek 公司。

1.3 方法

1.3.1 成骨细胞的分离

取新生的SD大鼠约10只，脱臼处死后投入盛有75%乙醇的容器内消毒5min，取出置于消毒培养皿中。无菌条件下剪去头顶部皮肤，取出颅盖骨，然后放入盛有PBS缓冲液（含100U/mL青霉素和100mg/L链霉素）的培养皿中，清除骨膜、血管等结缔组织，用PBS缓冲清洗2次后将洗净的颅盖骨剪成1mn小片。移入0.25%胰蛋白酶溶液中，37℃下预消化20min，以消除纤维组织。消化6个循环，每个循环20min，前2次循环去掉沉淀，后4次循环取沉淀，1000r/min离心10min，细胞以适当的密度接种到培养瓶中，放入37℃，5%CO培养箱中培养，次日换液，以后每隔2d换液1次，待细胞融合80%左右后，用胰蛋白酶进行消化传代，本次实验所采用的是3代或4代细胞。每项实验重复3次。

1.3.2 成骨细胞鉴定

取3代或4代细胞，接种于6孔板中，待细胞生长贴壁后，去掉培养基，用4℃2.5%戊二醛冷固定10min，然后按照BCIP/NBT试剂盒进行染色操作，倒置显微镜下观察。

1.3.3 细胞增殖实验

取3代或4代成骨细胞，用0.25%胰酶消化制成细胞悬液，以每孔3×10/mL接种于96孔板中，每孔100μL，同时设置空白调零孔。细胞常规培养24h后，换入不同浓度的护骨胶囊溶液，于规定的时间点进行检测，加入不含血清的培养基100μL，同时加入10μL的0.5%MTT，孵育4h后，去掉培养基，加入100μLDMSO，振摇至结晶完全溶解后，用酶标仪在490nm处检测其OD值。

1.3.4 碱性磷酸酶实验

24孔板中每孔接种4×10/mL细胞，培养24h后，加入不同浓度的护骨胶囊溶液，隔天换液，培养7d后，先用PBS清洗2遍，吸干后加入250μL蒸馏水，反复冻融2次并超声后，按碱性磷酸酶试剂盒进行后续操作。

1.3.5 RT—qPCR实验

于给药7d后，提取总RNA，检测Runx2 mRNA表达水平。所用引物根据GeneBank database所发布的序列设计并合成，总RNA的提取采用Trizol一步法进行，核酸蛋白微量定量仪检测纯度并计算浓度，然后取一定量的总RNA将其逆转录为cDNA。逆转录体系、PCR扩增体系及反应条件均参照说明书设定。反转录反应后，采用实时SYBR green I嵌合方法检测RT—PCR（荧光定量）。根据Ct值比较基因的表达量，各目的基因表达水平差异的比较采用“变化倍率=2” 计算。见表1。

1.4统计学处理方法

所有实验数据采用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示。多个样品均数比较采用单因素方差分析（One—Way ANOVA），如方差齐性，则组间两两比较采用SNK法，方差不齐采用Dunnett’s T3法，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 成骨细胞的鉴定

细胞染色后，绝大多数细胞在倒置显微镜下观察，细胞膜、细胞质及周围有蓝紫色的细微颗粒或片状沉淀，表明成骨细胞纯度高（结果如图1所示）。

2.2细胞增殖实验

结果见表2。成骨细胞在药物组作用48h后，药物组浓度在0.025~2.5μg/mL内，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05），而在浓度25μg/mL，与空白组比较，差异无统计学意义（P>0.05），表明护骨胶囊在浓度0.025~2.5μg/mL内对成骨细胞有一定的增殖作用。阳性药物NaF组，与空白组比较，差别有统计学意义（P<0.05），表明阳性药物在该浓度下对成骨细胞有促增殖的作用。药物组在浓度0.025~2.5μg/mL内，与阳性药物组比较，差无统计学意义（P>0.05）。药物组在浓度25μg/mL，与阳性药物组比较，差别有统计学意义（P<0.05），表明药物在高剂量下，对成骨细胞的增殖作用不如阳性药组。

2.3碱性磷酸酶实验

注：与空白组比较，*P<0.05。

图2 护骨胶囊对碱性磷酸酶酶活性的影响

结果见图2。成骨细胞在药物组作用7d后，药物组浓度在0.025~25μg/mL内，与空白组比较，差别有统计学意义（P<0.05），说明药物组能提高碱性磷酸酶活性。阳性药物NaF组，与空白组比较，差别有统计学意义（P<0.05），说明阳性药组也能提高碱性磷酸酶活性。药物组在浓度0.025~25μg/mL内，与阳性药物组比较，差别无统计学意义（P>0.05），说明药物组和阳性组对碱性磷酸酶活性的影响相当。

2.4 RT—qPCR实验

表3 SYBR green I RT—PCR检测成骨细胞Runx2基因的mRNA表达水平（n=3，±s）

注：与空白组比较，*P<0.05，与NaF组比较，#P<0.05。

结果见表3。药物组在浓度25μg/mL与空白组比较，差别有统计学意义（P<0.05），其余各组与空白组比较，差别均无统计学意义（P>0.05），表明护骨胶囊对成骨细胞Runx2基因的mRNA表达水平有一定的上调作用。阳性药物组NaF在浓度10mol/L,与空白组比较，差别无统计学意义（P>0.05）。药物组在浓度0.25~25μg/mL内，与阳性药物组比较，差别无统计学意义（P>0.05）。药物组浓度在0.025μg/mL，与阳性药物组比较，差别有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

骨质疏松是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加以及易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病，是骨代谢失衡的结果。而成骨细胞在其中扮演着重要的角色，它不仅决定骨形成，同时也调节破骨细胞的骨吸收，是骨代谢的重要功能细胞。成骨细胞的增殖与分化受到抑制，从而使骨质量和骨量下降，骨小梁稀疏、断裂，是导致骨质疏松的病理机制之一，因此防治骨质疏松与提高成骨细胞的增殖和分化水平密不可分。ALP是成骨细胞分化的特异性标志之一，骨形成时成骨细胞可分泌大量的ALP参与骨的矿化，因此ALP活性可以反映成骨细胞的活性状况。我们通过本实验发现，护骨胶囊在一定的浓度范围内对成骨细胞有促增殖和促分化的作用。单促分化的作用并不成剂量依赖性的关系，这可能与中药的治疗多靶点的作用相关，而近些年来也发现Runx2是成骨细胞特异性转录因子，在成骨细胞的分化成熟以及骨形成中起着关键性的作用，而护骨胶囊对其有上调的作用，在某种程度上可以说明护骨胶囊可能通过上调Runx2基因的mRNA表达水平发挥促分化的作用，其更深层次的调控机制仍有待进一步研究。◆

参考文献

[1]洪曼杰，卢丽，王晓东，等.中药复方护骨胶囊治疗原发性骨质疏松症的临床研究[J].中国骨质疏松杂志，2008,14（12）：891-895.

[2]王晓东，邓伟民，洪曼杰，等.护骨胶囊治疗绝经后骨质疏松症的临床研究[J].实用医学杂志，2011,27（9）：1662—1664.

[3]刘钰瑜，崔燎，吴铁，等.大黄素对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的影响[J].中国药理学通报，2005,21（2）：235-240.

[4]Liva K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using Real-time quantitative PCR and 2—method[J].Metho—ds，2001，25:402—408

[5]Coffman J A.Runx transcription factors and the developmental balance between cell proliferation and differentiation[J].Cell Biol Int,2003,27(4):315-324

[6]Sun D M, Liu Zh B, Zhao Y, et al.Runx2 is involved in regulating osterix promoter activity and gene expression [J].Prog Biochem Biophys,2006,33(10):957—964.