锂离子对三种豆科植物种子萌发的影响

指导老师：李三相 作者：吴娜

（天水师范学院 生物工程与技术学院 甘肃 天水 741000）

摘要：分别用不同浓度的LiCl溶液（0mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L、240mg/L、280mg/L、320mg/L、360mg/L、400mg/L）处理绿豆，扁豆，蚕豆种子，研究锂离子对三种豆科植物种子萌发过程中的生理生化指标的影响。结果表明：随着锂离子浓度逐渐升高，锂离子对种子萌发的抑制作用越明显，种子的发芽率、发芽势和发芽指数都降低。在锂离子浓度逐渐增大时，虽然前期种子萌发，但是在生长的过程中由于锂离子的抑制作用平均芽长严重下降，大部分逐渐死去，在锂离子浓度为400mg/L时抑制作用最大，发芽率 、发芽势，发芽指数均降到最低。过氧化物酶活性也随着锂离子浓度的逐渐升高而增强，脯氨酸含量随着锂离子浓度的增加而增大。

关键词：绿豆，扁豆，蚕豆；锂离子；种子萌发；过氧化物酶活性；脯氨酸含量

Effect on three kinds of legumes seeds germination under the stress of the different concentration Lithiumion

Instructor: Li Sanxiang Author: Wu Na

(College of biological engineering and institute of technology at Tianshui Normal University in Gansu, Tianshui 741000)

Abstract:Under the stress of the different concentration Lithiumion（0mg/L,40mg/L,80mg/L,120mg/L,160mg/L,200mg/L,240mg/L,280mg/L,320mg/L,360mg/L,400mg/L）some physiological and biochemical indexes of the mung beans, lentils, broad bean seeds germination were determined . The results show that: with the increase of concentration of lithium, the germination rate ,the germination potential and germination index decreased respectively. With lithiumion concentration increased gradually, although in the early stage ,the seed can germinate,when the concentration of lithumion increased,the length of sprouts gradually decreased.When the lithiumion concentration is 400mg/L,the germination rate， germination potential and germination index reach to a minimum. With the rising of lithiumion concentration, peroxidase activity also increased, proline content increased with the increase of lithiumion concentration.

Keywords:mung bean,lentils, broad bean, The lithiumion, Seed germination,The activity of peroxidase,Proline content

1前言

豆科植物在全世界范围内广泛种植，既是重要的粮食作物又具有较高的经济价值，在食用、药用、饲用等方面均发挥着巨大的作用。它是人类食品中淀粉、蛋白质、油和蔬菜的重要来源之一，也是优良的绿肥和饲料作物[1]。豆科植物主要优点为: 适应范围广、抗逆性强、耐瘠薄、易栽培、生长迅速、萌蘖力强、生物量高、轮伐期短、热值高[2]。但是由于一些豆科植物种子具有坚厚且不透水气的种皮,阻碍了种子萌发,从而导致种子出现发芽率低,发芽期长， 发芽不整齐等现象,给豆科植物生长发育方面带来了一定的影响[3]。近年来,为了解决这一问题,众多学者将豆科植物种子萌发的研究重点集中在种子活力，物理因素和化学因素的处理方法上[4]。该文对化学因素中离子浓度对种子萌发的影响方面取得的研究进展加以综述,以期对豆科植物种子萌发的深入研究提供依据。

锂具有高的比热和电导率，是自然界中最轻的金属元素。它是非常活泼的碱金属元素，常温下它是唯一能与氮气反应的碱金属元素。锂在发现后一段相当长的时间里，一直受到冷落，仅仅在玻璃、陶瓷和润滑剂等部门，使用了为数不多的锂的化合物。但是，随着科技突飞猛进的发展，使锂的用途越来越广泛。目前，我国大约每年销售60亿只电池，其中一次性电池产量最大，应用最广，这种电池不能用简单方法再生，不能充电，使用后的废电池一般多随生活垃圾堆放或随意丢弃也正是因为锂的广泛使用，使环境中的含锂化合物越来越多[3,4]。而锂离子对豆科植物种子萌发的影响至今还没有人研究，本实验就是研究不同浓度锂离子对三种豆科植物种子萌发的影响，以期为环境监测提供相关数据。

2实验材料和方法

2.1材料和仪器

材料：蚕豆种子（660粒），绿豆种子(660粒)，扁豆种子（660粒），所有化学试剂均为分析纯。

器材：电子分析天平；722型可见分光光度计；高速冷冻离心机；自动双重纯水蒸馏器；水浴锅。

2.2实验方法

2.2.1发芽试验

取干净的培养皿，分组编号，在培养皿中放人籽粒大小均匀，健康饱满绿豆种子，种子提前消毒(用0.1%的Hgcl2消毒10min)，种子每皿30粒。每个浓度做两个平行，分别以不同浓度（0mg/L、40mg/L、80mg/L、120mg/L、160mg/L、200mg/L、240mg/L、280mg/L、320mg/L、360mg/L、400mg/L）的LiCl溶液浸泡处理12h。将浸种后的种子用蒸馏水洗净，在培养皿中铺三四层纱布，并加入各浓度的LiCl溶液，在20℃左右的环境中进行培养。每天观察记录发芽种子数，并补充蒸发的水分至衡重以保证培养皿中的锂离子浓度维持恒定。在规定天数内结束发芽，在第三天测发芽势，第五天测发芽率，计算发芽指数。两组平行实验取平均值。蚕豆、扁豆培养方法同上。

计算公式[4]：

发芽率(%)=(正常发芽种子数/供试种子总数)×100%

发芽势（%）=（规定时间内正常发芽的种子数/供试种子总数）×100%

发芽指数(GI)=∑（Gt/Dt）(Gt为t时间内的发芽数，Dt为相应的发芽天数)

2.2.2过氧化物酶活性的测定

萌发试验第七天，根据植物生理学实验指导 张志良主编的愈创木酚比色法[5]，测定过氧化物酶活性。依据具体实验条件及实验需求，略有改动，不同的为取材上称取的实验材料为三种豆科植物的芽0.2g。

（以0.5min内OD变化值表示酶活性大小, 即以OD470 /[ 0.5min·0.2g(鲜重)] 表示。

2.2.3脯氨酸含量测定

参考张志良的方法进行[6]。

脯氨酸标准曲线的绘制

（1）配置100ug/ml的脯氨酸原液。

（2）取6个50ml容量瓶，分别吸取脯氨酸0.5ml，1.0ml，1.5ml，2.0ml，2.5ml用蒸馏水定容，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5 μg/ ml。

（3）取6支试管，分别吸取2ml(2)中的脯氨酸溶液及2ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，在沸水浴中加热30min。

（4）冷却后，加入4ml甲苯，振荡，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。

（5）用医用注射器轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，用甲苯溶液为空白对照，于520nm波长处进行比色。

（6）标准曲线的绘制，用Excel表格绘制。

样品的测定

（1）脯氨酸的提取：分别准确称取不同浓度LiCl溶液培养后的绿豆、扁豆、蚕豆的芽0.5g，分别置大试管中，然后向各管分别加入5mL3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中经常摇晃提取10min，冷却后过滤至干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。

（2）显色反应及测定：吸取2mL提取液于另一干净的带棉塞的试管中，加入2ml冰醋酸及2mL酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30min，溶液即呈红色。冷却后加入4mL甲苯，摇荡30S，静置片刻，取上层液至10mL离心管中，以3000 rpm/min离心5min后，用移液器轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计520nm波长处比色，求得吸光度值。

（3）结果计算：从标准曲线上查出2ml测定液中脯氨酸的含量（Xμg/2ml）。

3.1不同浓度锂离子对三种豆科植物种子萌发的影响

3.1.1不同浓度Li+溶液对三种豆科植物种子发芽率的影响

图1 锂离子处理对三种豆科植物种子发芽率的影响

从图1可以看出，随着锂离子浓度逐渐升高，三种豆科植物种子的发芽率整体呈下降趋势。将三种豆科植物种子的发芽率相互比较得出，与对照组相比较，当锂离子浓度为40mg/L时，对绿豆和扁豆种子的发芽率都没有影响，而蚕豆的发芽率下降3.3%。当浓度为80mg/L时，绿豆的发芽率与对照组相比较没有影响，扁豆、蚕豆各下降2.7%、15%。当锂离子浓度为120mg/L时，对绿豆种子发芽率没有影响，扁豆、蚕豆的发芽率分别下降4.4%、18.3%。当锂离子浓度为160mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽率分别下降3.3%、10%、20.1%。当锂离子浓度为200mg/L时，绿豆发芽率下降6.6%，扁豆和蚕豆发芽率分别下降20%、23.3%。当锂离子浓度为240mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽率分别下降10%、25%、30%。当锂离子浓度为280mg/L时，与各自对照相比较，绿豆、扁豆、蚕豆发芽率分别下降10%、26.6%、36.4%。当锂离子浓度为320mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆发芽率分别下降10.9%、26.6%、38%。当锂离子浓度为360mg/L时，发芽率分别下降12.6%、28.3%、38%。当锂离子浓度为400mg/L时。与对照相比较，发芽率分别下降13.3%、28.3%、40%。因此得出结论，随着锂离子浓度的逐渐升高，锂离子对三种豆科植物发芽率的影响由大到小依次为蚕豆＞扁豆＞绿豆。

3.1.2不同浓度Li+溶液对三种豆科植物种子发芽势的影响

图2 锂离子处理对三种豆科植物种子发芽势的影响

从图2得出，随着锂离子浓度的逐渐升高，三种豆科植物的发芽势整体呈下降趋势， 与对照组相比较，当锂离子浓度为40mg/L时，对绿豆、扁豆、蚕豆种子的发芽势分别下降0.8%、3.7%、4.3%。当浓度为80mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆发芽势分别下降3.9%、11.4%、15.8%。当锂离子浓度为120mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽势分别下降4.2%、11.7%、18.9%。当锂离子浓度为160mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽势分别下降9.2%、12.1%、24.8%。当锂离子浓度为200mg/L时，绿豆发芽势下降12.9%，扁豆和蚕豆发芽势分别下降25.4%、28%。当锂离子浓度为240mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽势分别下降13.2%、28%、34.1%。当锂离子浓度为280mg/L时，与各自对照相比较，发芽势分别下降13.2%、29.5%、34.7%。当锂离子浓度为320mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆发芽势分别下降13.9%、29.8%、37%。当锂离子浓度为360mg/L时，发芽势分别下降14%、30.9%、37.7%。当锂离子浓度为400mg/L时。与对照相比较，发芽势分别下降17.1%、35%、40.9%。以此得出结论，随着锂离子浓度的逐渐升高，锂离子对发芽势的影响由大到小依次为蚕豆＞扁豆＞绿豆。

3.1.3不同浓度Li+溶液对三种豆科植物种子发芽指数的影响。

图3 锂离子处理对三种豆科植物种子发芽指数的影响

讨论不同浓度锂离子对三种豆科植物种子萌发过程中发芽指数的影响，由图3得出，随着锂离子浓度的逐渐增大，三种豆科植物的发芽指数逐渐降低。与对照组相比较，当锂离子浓度为40mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽指数分别下降4.9%、6.3%、7.0%。当浓度为80mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆发芽指数分别下降5.16%、10.6%、17.6%。当锂离子浓度为120mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽指数分别下降5.3%、11.2%、24.3%。当锂离子浓度为160mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽指数分别下降5.4%、11.4%、27.8%。当锂离子浓度为200mg/L时，绿豆发芽指数下降13.4%，扁豆和蚕豆发芽指数分别下降21.5%、29.5%。当锂离子浓度为240mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆的发芽指数分别下降16.4%、30.4%、36.7%。当锂离子浓度为280mg/L时，与各自对照相比较，发芽指数分别下降17.2%、33.4%、41.7%。当锂离子浓度为320mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆发芽指数分别下降21.1%、33.8%、44.5%。当锂离子浓度为360mg/L时，发芽指数分别下降21.8%、36.7%、45.6%。当锂离子浓度为400mg/L时。与对照相比较，发芽指数分别下降23.8%、38.9%、47%。因此得出结论，随着锂离子浓度的逐渐升高，锂离子对发芽指数的影响由大到小依次为蚕豆＞扁豆＞绿豆。

3.2不同浓度Li+溶液对三种豆科植物种子萌发过程中过氧化物酶活性的影响

植物细胞内存在清除氧自由基的酶促保护系统和非酶促的保护系统，SOD、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶(CAT) 、抗坏血酸过氧化物酶(APX)是酶保护系统中的重要组成。过氧化氢在适当浓度下具有促进作物种子萌发的作用。传统认为他可轻度腐蚀种皮，提高其透性，为种子提供充足的氧气而解除休眠[7]。POD 是植物中一种重要的保护性酶，是清除过氧化氢的重要保护酶, 能将H2O2 分解为O2 和H2O , 从而使机体免受过氧化氢的毒害作用，种子萌发过程中过氧化氢的降解主要靠CAT,POD主要行使吲哚乙酸氧化酶的功能[8]。本实验中，POD随Li+浓度的变化而变化。

植物体内POD、SOD是活性氧自由基清除系统中的两个重要保护酶，SOD、POD活性的提高表明植物体保护机能的启动和增强，是保护细胞免受毒害的调节反应，但其调节能力是临时的和有限的[9]。图4表明，随着锂离子浓度的逐渐增加，三种豆科植物的过氧化物酶活性逐渐增加，细胞的保护能力增强。当锂离子浓度为40mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆过氧化物酶活性依次比对照组增加了45.37%、137.9%、201.64%。当锂离子浓度为80mg/L时，依次比对照组增加了46.53%、138.71%、424.59%。当锂离子浓度为120mg/L时，依次比对照组增加了82.41%、155.65%、451.64%。当锂离子浓度为160mg/L时，绿豆，扁豆、蚕豆脯氨酸含量比对照组增加了84.03%、158.07%、465.57%。锂离子浓度为200mg/L时，依次比对照组增加了92.82%、261.29%、565.57%。锂离子浓度为240mg/L时，依次比对照组增加了93.06%、450.81%、656.56%。当锂离子浓度为280mg/L时，脯氨酸含量依次比对照组增加了100.9%、458.07%、687.71%。所以从POD活性来看，锂离子对三种豆科植物的抑制作用由大到小依次为：蚕豆＞扁豆＞绿豆。

图4 Li+处理对三种豆科植物芽中过氧化物酶活性的影响

注：在种子萌发试验第七天，由于锂离子对种子萌发的抑制作用，虽然前期种子萌发，但是后期高浓度的锂离子使得种子逐渐凋亡死去，所以无法测三种豆科植物芽中过氧化物酶活性，只取了锂离子浓度在0 mg/L-280 mg/L范围进行检测。320 mg/L -400 mg/L的芽在第七天已经凋亡。

3.3 不同浓度 Li+ 对三种豆科植物种子萌发过程中脯氨酸含量的影响

植物体内的脯氨酸可降低细胞渗透势, 维持压力势,保持和稳定大分子物质,参与叶绿素合成, 维持细胞膜的正常功能, 故植物在逆境胁迫下体内Pro大量积累，Pro的含量也可作为判断植物受胁迫的程度[10]。

由图5可以看出，随着锂离子浓度的增高，样品中脯氨酸含量也增大。从锂离子对三种豆科植物种子萌发的抑制程度来比较，当锂离子浓度为40mg/L时，绿豆、扁豆、蚕豆脯氨酸含量与各自对照相比依次增加13.50%、24.12%、55.08%。当锂离子浓度为80mg/L时，依次为对照组的32.40%、61.98%、70.45%。当锂离子浓度为120mg/L时，依次比对照组增加了36.83%、76.55%、135.70%。当锂离子浓度为160mg/L时，绿豆，扁豆、蚕豆脯氨酸含量比对照组增加了44.50%、99.33%、169.03%。锂离子浓度为200mg/L时，依次比对照组增加了50.76%、106.53%、214.89%。锂离子浓度为240mg/L时，依次比对照组增加了55.29%、125.29%、258.39%。当锂离子浓度为280mg/L时，脯氨酸含量依次比对照组增加了71.27%、145.73%、304.02%。因此得出结论，在不同浓度的锂离子胁迫下，三种豆科植物的受胁迫程度依次为：蚕豆＞扁豆＞绿豆。

图5 锂离子处理对三种豆科植物芽中脯氨酸含量的影响

注：锂离子浓度为320 mg/L -400 mg/L时芽凋亡无法检测其脯氨酸含量。

4.结论

种子活力是种子质量优劣的一个重要方面，它指的是种子的健壮度，包括迅速整齐的发芽潜力，是一种为基因型所决定的并为环境因素所改变的生理特性[11]。活力指数可以在一定程度上表示种子在萌发过程中营养物质的分解和重建状态[12]。从不同浓度Li+对三种豆科植物种子发芽率、发芽势、发芽指数的影响来看，与对照组相比较，三种指标均随着锂离子浓度的逐渐升高而减小。随着锂离子浓度的逐渐升高，锂离子对这三种指标的影响由大到小依次为：蚕豆＞扁豆＞绿豆。

植物体内脯氨酸含量在一定程度上反应植物的抗逆性，逆境条件下植物体内脯氨酸含量的上升可视为植物的保护性反应[13]。 前人研究表明，脯氨酸作为重要的渗透调节物质，它的积累一方面可能是细胞结构和功能遭受伤害时机体做出的反应[14]，另一方面也是植物在逆境下的适应表现，是一种防护效应[15] 。

在过氧化物酶活性的测定中，不同浓度的锂离子对三种豆科植物种子萌发过程中的抑制作用是不同的，从过氧化物酶活性和脯氨酸含量两个指标来综合分析，不同的植物对锂离子的抗性存在差异，综合这几种生理指标来看，绿豆适宜的锂离子浓度范围更大，而扁豆和蚕豆对锂离子比绿豆敏感，绿豆更适合在锂离子污染过的土地上播种。

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致 谢

本论文是在李三相老师的悉心指导下完成的。李老师严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。在完成论文的这几个月中，李老师对我学习、实验和研究等方面都作了细心指导，并从思想上耐心教导与启发，使我深刻的明白了许多书本上都不能学到的学习和科研的思想方法和待人处事原则。本论文从选题到完成，每一步都是在李老师的指导下完成的。李老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。在此，谨向李老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！

本论文的顺利完成，还离不开各位老师、同学的关心和帮助。感谢刘三许，倪赛等同学的帮助，使得本实验得以顺利快速地完成。