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维普资讯 http://www.cqvip.com 王忠田等：新城疫病毒分子生物学最新研究进展 ３３ 新城疫病毒分子生物学最新研究进展 王忠田 ，王泽霖 ，陈溥言 ，杨汉春。 （１河南农业大学牧医工程学院，河南部ｌ州４５００Ｏｇ；２南京农业大学动物医学院，江苏南京Ｚ１００９５｝ ３中国农业大学动物医学院，北京１０００９４） 中国分类号：Ｓｇ５２．６５ 文献标识码 Ａ 文章编号：１０ ０７—５Ｏ３８（２００２）Ｏ２ ００３３叫 Ｓ。３５ ＳＲＮＡ为一个单一的ｍＲＮＡ片段，编码 摘 要：新城疫病毒（ＮＤＶ）是一种严重危害养 Ｓ和３５ ｋｉＮ。１８ ＳｍＲＮＡ含有基因组中 禽业的重要病原。本文就对ＮＤＶ的分子生物学 Ｌ蛋白。分子量为２２０ 特征、结构蛋白及其功能、ＮＤＶ的致病本质、分 所有剩余的独特的ｍＲＮＡ，可分别能编码Ｍ，ＨＮ，Ｆ， ＮＰ，Ｐ五种蛋白。Ｎｏｒｔ ｈｅｒｎ杂交证明，ｌ８ ｓ和３５ ＳｍＲ 子诊断技术和疫苗研究等方面进行了较为详尽 的综述。 关键词：新城疫病毒；分子生物学； 诊断 随着ＮＤＶ分子生物学研究的目益深入，人们发 ＮＡ包含了所有的编码区域，而２８ Ｓ包含＿『１８ ＳＲＮＡ 的编码区域．表明它可能是１８ ｓ的共价连接产物。２２ ｓ ｍＲＮＡ不台特异片段，但转录产物与ｌ８ ｓ相似，代表 多顺反子信息 病毒基因组有９８，８ 被转录成上述 现ＮＤＶ不同毒株之问的免疫原性和毒力主要与其Ｆ 六种蛋白的ｔｕＲＮＡ，各基因组间有一个３ ＡＡ保守 蛋白和ＨＮ蛋白有着密切的关系。这就有必要对ＮＤＶ 序列。ＮＤＶｍＲＮＡ的转录是以Ａ开始的，在各组ｍＲ— 的分子生物学水平进行全面系统的了解和研究。 ＮＡ之前均有一个保守的起始信号３ 一ＵＧＣＣＣＡＵＣＵ— １ ＮＤＶ的分子生物学特征 Ｕ一５ 且每一基因末端含有转录的终止信号序列．即 １．１ ＮＤＶ的基因组特征 ３＇－ＡＵＵＣＬ『ＵＵＵＵＵ ５ 序列和与ｍＲＮＡ互 补的 ＮＤＶ是一单链负股ＲＮＡ病毒，其基因组长度约 ｐｏｌｙＡ。ＩｎＲＮＡ的起始信号和ｐｏｌｙＡ之间的距离不等， 为１５ ｋｂ，分子量约为５１～５７ ｋｉＮ。病毒感染细胞后， 通常在１～４７个核苷酸之间Ｅｌｉ（如图１） 基因组产生三组ＲＮＡ，沉降系数分别为１８ Ｓ．２２～２８ ３ …ＮＰ Ｐ Ｍ Ｆ ＨＮ Ｌ 一 ５ ／Ｊ ＼ ＡＵＵＣＵＵＵＵＵＵ ＧＡＡ 同源序列 ＳＩＥ分别表示ｍＲＮＡ的起始序列， 基田问和终止序列 圈ｌ ＮＤＶ基因组结构模式 １．２ ＮＤＶ的结构蛋白特征 ＮＤＶ有ＮＰ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮ、Ｌ六种病毒特异性结 产生溶血。Ｆ蛋白的前体ＦＯ在细胞内被细胞的胰蛋白 水解酶裂解为Ｆ 和Ｆ，两条多肚链．分子量大小分别 为５５ ｋｉｎ和１２ ｋｉｎ。它们以羧基端嵌合在病毒囊膜 上。两个亚单位以二硫键连接，其顺序为ＮＨ２一Ｆ Ｓ－Ｓ— Ｆ。一ａ）Ｃ）Ｈ。裂解后的Ｆ。多肽的Ｎ端产生一个疏水氨 基酸区域，直接参与融合活动一 。Ｆｚ的高度疏水可能 与融台作用有关。现在研究表明，Ｆ多肽有３个高度疏 水区，即Ｎ端信号肽，Ｆ 的Ｎ端和Ｃ端跨膜区域 有 五个糖基化位点，１个在 多肚上，４个在Ｆ 多肽上 信号肚区和融合诱导区分别具有使蛋白跨膜转位和直 接参与膜融合的功能。蛋白跨膜区具有终止蛋白转移 和膜定位的功能 Ｔｏｙｏｔａ等¨ｊ应用一组针对不同ＮＤＶ Ｆ蛋白的单 克隆抗体、抗原结构进行分析，认为Ｆ蛋白含有３个抗 原决定簇，分别位于３４３，７２和１６１位，其中位点１ 构蛋白。其中｝ 蛋白与Ｆ蛋白是重要的宿主保护性 抗原：ｚ脚。 １．２．１ Ｆ蛋白Ｆ基因从其转录起始信号到Ｐ０１ｙＡ 尾巴约有ｌ ７９０个核苷酸。Ｆ基因有一个开放阅读 框 ］。其转录的起始信号是ＡＣＧ００ＴＡＧＡＡ，在１ ７８３ ～ １ ７８６位含有与真核生物相同的终止密码子ＴＡ（Ａ） Ｇ 病毒的Ｆ基因转录、翻译成Ｆ蛋白。Ｆ蛋自由５５３ 个氨基酸组成，分子量为５９．６６ ｋＤａ。它位于病毒的囊 膜上，主要负责病毒与易感细胞发生融合、进入细胞和 收稿日期：２００１—０８ ２１ 作者简介：王忠田（１９７２一），男，河南省宁陵县人，现于中国农 业大学动物医学院攻读预防兽医学专业博士研究生，主要从事 动物病毒分子生物学研完。
维普资讯 http://www.cqvip.com 动物医学进展２００２年第２３卷第２期（总第１１８期ｊ （Ｌｅｕ一３４３）位于Ｆ 亚基ｃ末端高度保守的半胱氨酸富 集区，在病毒的抗原性及结构和功能上起重要作用 Ｆ 和Ｆ 裂解位点之间有一个半胱氨酸残基．有利于位于 Ｆ 亲水区的位点ＩＩ（Ａｓｐ ７２）同Ｆ Ｎ末端接近，形成与 抑制融合相关的抗原表位 位点ＩＩＩ（Ｔｈｒ＿１６）位于Ｆ Ｎ 端，与前两个位点相比，该区的亲水性较低，被认为是 病毒的融合体．它使病毒与细胞之间通过疏水作用而 融 。 Ｌ ２、２ ＨＮ蛋白ＮＤＶ的ＨＮ基因全长２．０ ｋｂ．基 因序列中有一个长的开放式阅读框，通常编码５７７个 氨基酸，推测其分子量约为６．３ ｋＤａ。ＨＮ糖蛋白具有 血凝素和神经氨酸酶活性，在病毒侵染过程中起着识 别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜的作用 ］。ＮＤＶ可 被ＨＮ单抗和特异性ＨＮ蛋白抗血清所中和＿。］。应用 单抗研究表明ＨＮ蛋白的血凝素和神经氨酸酶两个位 点在抗原性上是独立的ｌｌ… ＨＮ蛋白氮基酸序列中有 六个潜在的糖基化位点，主要疏水区靠近Ｎ端，表明 ＨＮ是蹦Ｎ端与病毒外膜相连的。多肽Ｎ端一侧的极 性氨基酸亲水性分析表明缺乏裂解信号＿ｌ 糖基化作 用对ＨＮ向膜转运无作用，但对神经氨酸酶的作用是 必需的ｌｌ 。Ｍｃｉｎｎｅｓ和Ｍｏｒｒｉｓｏｎ￣ 对ＮＤＶ ＡＶ株的 ＨＮ蛋白的六个糖基化加成位点进行突变研究表明， 糖基化对蛋白质的折叠及活性有重要作用。 Ｌ ２．３ ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白和Ｌ蛋白ＮＰ蛋白、Ｐ蛋白 和Ｌ蛋白与病毒基因组ＲＮＡ相结合构成病毒核衣 壳。ＮＰ蛋白有２个主要区域，一是氮基酸区域，约占 ＮＰ蛋白的三分之二，它与ＲＮＡ直接结合；另一是羧 基端区域，裸露在装配后的核衣壳表面，胰蛋白酶处理 后．可 从核衣壳上解离下来。Ｐ和Ｌ蛋白与病毒基因 组的转录有关．它们与病毒模板一起构成转录复合物。 其中Ｌ蛋白是ＮＤｖ基因组编码最大的蛋白，是一种 病毒ＲＮＡ依赖性的聚合酶¨１ 。有证据表明，Ｐ蛋白是 病毒特异的 。 １．２．４ Ｍ蛋白ＮＤＶ的Ｍ蛋白是一个由３４６个氨 基酸组成的多肽，分子量为３９．７ ｋＤａ＿ｌ 。Ｙｏｓｈｉ ｄａ 等一 通过试验认为．在Ｍ蛋白和膜内糖蛋白之问存 在着特异的识别位点 Ｐｅｅｐｌｅ和ｂｒａｔｔｌ】”提出Ｍ蛋白 与融合糖蛋白（Ｆ）之间的重要相互作用对于有感染性 的病毒粒子的形成是必需的。除上述蛋白外，ＮＤＶ基 因组还编码两种非结构蛋白，分别为３３ ｋＤａ和３６ ｋｉｎ，大概是由Ｐ蛋白的同一框架编码的。 ２ ＮＤＶ致病的分子基础 随着分子生物学技术的发展．近年来对ＮＤＶ的 分子结构与致病性的关系进行了深人研究，发现了不 同致病性毒株在分子结构上的差异揭示了ＮＤＶ不同 毒力的分子生物学本质。 自１ ９８６年Ｃｈａｍｂｅｒ等第一次报道ＮＤＶ的桉苷 酸序列以来，已有大量文献陆续报道了ＮＤＶ不同毒 株的基因序列。经ＮＤＶ结构蛋白多肽指纹图谱分析 发现．所有ＮＤｖ毒株ＮＰ，Ｐ．Ｉ 蛋白分子结构基本一 致．而Ｆ，ＨＮ蛋白氨基酸却存在较大差异，并且毒力 差异越太．Ｆ．ＨＮ蛋白氨基酸差异也越明显 遗传学分 析表明：当弱毒株Ｉ ａｓｏｔａ的变异株毒力增强时，其 ＮＰ．Ｐ，Ｌ，Ｍ，ＨＮ蛋白均无明显的差异，而Ｆ蛋白的存 在形式却明显改变。这一结果表明，ＮＤＶ糖蛋白尤其 是Ｆ蛋白在ＮＤＶ致病性上发挥着重要作用。Ｐｅｅｔｅｒｓ 等 在１９９９年再次报道了Ｆ蛋白是一主要决定毒力 的蛋白。Ｍａｒａｋａｍｉ利用杆状病毒表达系统研究ＮＤＶ ＨＮ和Ｆ蛋白时发现，单独表达ＨＮ或Ｆ蛋白时细胞 没发生融合．而当Ｈ 与Ｆ基因在同一细胞中表达 时，却有明显的台包体出现 Ｍｏｒｒｉｓｏｎ 等也报道ｒ同 样结果 这表明决定ＮＤＶ毒力的主要因素是Ｆ蛋白， 其次是ＨＮ蛋白，并且二者有密切的联系。 ＮＤＶ的Ｆ蛋白先是蹦惰性前体Ｆ０的形式合成， 当它转运到高尔基体表面时，被宿主细胞蛋白酶裂解 成Ｆ 、Ｆ 两个亚单位，使病毒具有感染活性。裂解后的 活性蛋白一旦到达质膜表面珏『Ｊ可介导感染细胞与邻近 细胞的融合，并导致病毒新的感染。 Ｆ蛋白裂解位点位于ｕ２～１］６位的氨基酸处，其 氨基酸顺序及裂解能力是决定毒力的关键。Ｃｏｌｌｉｎｓ 等一” 对２６个ＮＤＶ毒株进行核营酸序列比较发现．所 有强毒株Ｆ蛋白裂解位点的氨基酸组成都是被由谷 氨酰胺隔开的碱性氮基酸对组成；而弱毒株或无毒株 相应的裂解位点碱性氨基酸划的第一个残基被Ｇｌｙ取 代一 ，另外．强毒株Ｆ 多肽首位残基是Ｐｈｅ．而弱、 。 睐 的该残基则被Ｌｅｕ取代．即强毒株的切割顺序一般 为“ ＲＲＱＫ／ＲＲ，Ｆ“ ；而弱毒株的通常为“ ＧＲ／ＫＱ— ＧＲ／Ｌ：“ 。这就是ＮＤＶ毒力强弱的关键所在。 ３ ＮＤＶ分子诊断技术研究进展 近年来，在ＮＤＶ的诊断Ｌ卜｜出现 ”非典型ＮＤ”． 使常规的ＨＡ，ＨＩ， ＩＣＰＩ，鸡胚接种，ｑｔ和试验等不能满 足生产实践的要求。因此，人们试图从核酸水平检测 ＮＤＶ并对强弱毒株进行区分。其中主要有ＲＮＡ指纹 图谱法．核酸探针法．裂解位点分析法及其多肽抗体法 和ＰＣＲ方法。Ｍｃｍｉｌｌａｒ等 。。首先用ＲＮＡ指纹图谱法 对Ｌａｓｏｔａ株进行了分析 其方法是用Ｔ１ ＲＮａｓｅ降解 病毒ＲＮＡ，然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行二维电泳 并放射自显影，得到ＲＮＡ各片段的分布图，并提出作 为ＮＤＶ检测和分析的一种手段，随后他们又对许多 株进行了分析．确定了其图谱和同源性。 Ｊａｒｅｃｋｉ Ｂｌａｃｋ＿】 设计了与ＮＤＶ Ｆ基因５ 端非编 码区互补的核苷酸探针．用该探针检测了１４个ＮＤＶ 毒株，包括强毒，中毒和弱毒，都出现了极好的杂交，同 时该探针不与禽流感病毒（Ａ１Ｖ），传染性支气管炎病 毒（ＩＢＶ），传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）杂交，说明该探 针是特异的。１９９３年他又设计 两个探针，该探针的 长度为２１个碱基．与强毒株 ＦＥＸＡＳ ＧＢ的Ｆ蛋白的 裂解位点基因互补，可与ｌ１个速发性毒株，５个中发
维普资讯 http://www.cqvip.com 王忠田等： 新城疫病毒分子生物学最新研究进展 性毒株的ＲＮＡ杂交，而不与所有的７个弱毒株的 ＲＮＡ杂交，这说明该探针能将弱毒株从强毒株和中毒 株巾区分出来，具有重大的应用价值 Ａｎｇｅｌａ等一 （１９９８）利用ＲＴ—ＰＣＲ扩增出３６２ ｂｐ的包括Ｆ蛋白裂 解位点序列的片段，制备成了相应的探针，并用ＰＣＲ 产物同型特异性探针杂交来区分德国流行的强弱毒 株。 Ｈｏｃｔｄｅｒ等 钥利用强毒株Ａｕｓｔｒａｌｉａ—Ｖｉｃｔｏｒｔａ （ＡＶ），弱毒株Ｑｕｅｅｎｓｔａｎｄ（Ｕ４）．Ｅａｖｅｓ—Ｇｒｉｍｅｓ（ＥＧ）， ＷＡ２Ｕ６株的裂解位点的氮基酸的组成和序列不同． 设计并人工合成了两个多肽，针对强毒株的序列为 Ｓｅｒ—Ｇｌｙ—Ａｒｇ—Ａｒｇ Ｇｌｎ，针对弱毒株的序列是：Ｓｅｒ—Ｇｌｙ Ｇ１ｙ Ｇｌｕ—Ａｒｇ—Ｇｌｕ—Ｇｌｕ，将这两个多肽分别与载体连接 制备兔抗血清，用抗血清可以区分不同毒株的毒力强 弱 王树双等ｒ ｑ利用相似的方法，通过免疫印迹对６ 种不同抗多肽抗体分析了国内现有的部分毒株毒力的 强弱．结果与接种鸡胚致死情况基本吻合。 ＰＣＲ是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在 疾病的检测方面有着广阔的应用前景，现已被广泛应 用 Ｊｅｓｔｉｎ： ｌ＿设计一对分别为ｌ８和ｌ９个碱基的引物， 分别对应于ＮＤＶ Ｆ蛋白／基因的一定区域，扩增出一 个２３８ ｂｐ的片段，产物经酶切鉴定，证明是特异的，能 用于ＮＤＶ的诊断和检测。宋长绪等０ 等也设计了针 对ＮＤＶ Ｆ基因裂解位点的引物，可以以强、中、弱毒 株核苷酸为摸板，扩出一个４８０ ｂｐ左右的片段．对 ＩＢＶ、ＥＤＳ一７６的核苷酸而扩增不出，说明该ＰＣＲ方法 是对ＮＤＶ是特异的，可以用来诊断和检测ＮＤＶ Ｋａｎｔ．ＡＬ２ ］（１９９８）利用４条引物Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ配成ＡＢ， Ａｃ，ＡＤ三对，ＡＢ针对所有毒株，ＡＣ针对强毒株，ＡＤ 针剥弱毒株，分别对只通过组织匀浆而提取的ＮＤＶ ＲＮＡ进行ＲＴ—ＰＣＲ，结果扩增出３６２，２５４．２５４ ｂｐ的 三个片段。他用ＲＴ—ＰＣＲ方法对ｌ１个ＮＤＶ强毒株．４ 个ＮＤＶ无毒株进行扩增，结果证明，该方法与传统方 法检测结果基本吻台 该方法不需要鸡胚接种，节省了 时间，２４ ｈ之内便可以出结果，为ＮＤＶ毒株的区别诊