高产酯化酶红曲霉菌株的筛选与诱变育种

学 生：陶清

生物科学技术学院 08生物工程二班，学号 200842145213

摘 要：为了获得具有高酯化能力的红曲霉菌株，通过从大曲中初筛选出9株红曲霉菌株，逐代处理后选出酯化酶产量高，特性好的菌株作为出发菌株，再对出发菌株进行紫外诱变，紫外与氯化锂复合诱变，硫酸二乙酯诱变等反复诱变，并进行筛选，结果得到酯化能力明显提高，遗传稳定，具有良好应用前景的菌株。

关键词：红曲霉； 诱变育种； 酯化能力； 筛选

前 言：传统大曲浓香型白酒发酵周期长（40-50d)，出酒率低，是浓香型白酒生产的瓶颈，缩短发酵周期和提高浓香型白酒中的乙酸乙酯含量是提高浓香型白酒的产量与质量的关键 。

一、红曲霉酿酒的研究背景

浓香型白酒的主体香味物质是乙酸乙酯，窖香浓郁，绵甜甘洌，香味协调，尾净余长，是浓香型白酒的主要特征，深受广大消费者的喜爱，是我国生产量最大的白酒品种，传统的发酵方式具有多出不足导致白酒酿造的成本投入过大，而收益不高。红曲霉在我国的应用历史悠久，红曲霉在发酵过程中能产生糖化酶，淀粉酶等一级代谢产物及色素，降胆固醇活性物质等次级代谢产物。对其研究主要集中在食用色素，药用性次级代谢产物上[1]。20世纪60年代初，中国科学院成都生物研究所吴衍庸教授从泸洒麦曲中分离到泸型酯化菌M101红曲霉菌株，为红曲在大曲白酒生产上的应用开拓了新途径，是我国白酒工业的一项重大创新[2]。本研究志在在选育出具有高酯化能力，能够用于浓香型白酒生产的红曲霉菌株。缩短浓香型白酒发酵周期，提高浓香型白酒质量和产量。

二、高产酯化酶的红曲霉的筛选

（一）材料

1、菌种

大曲样品（采自四川某名酒厂）

2、培养基

糟浸液富集培养基：酒糟浸液10％；乙醇4％，麦芽汁调节糖度到10°Brix乳酸调节pH到4．5。

糟浸液平板分离培养基：糟浸液10％；乙醇7％，麦芽汁调节糖度到10°Brix；琼脂2％，乳酸调节pH到4．5。

菌种保藏培养基：lO°Brix麦芽汁，可溶性淀粉2％，蛋白胨0．5％，冰乙酸0．2％，琼脂2％。

麦芽汁平板培养基：lO°Brix麦芽汁，蛋白胨0．5％，琼脂2％，乳酸调节pH到4．5。

麸皮曲培养基：麸皮100g；乙酸(36％)0．5mL；葡萄糖0．5 g；水75 mL。

（二）方法步骤

1、富集培养：

选出曲块中带红色的曲子，用小刀将红色部分刮出lg，放入100mL无菌水中，浸泡一小时后(边浸边摇)，静段备用。取上清液lmL于富集培养基中，摇匀，放入32℃培养箱中保温培养。

2、平板分离（初筛）：

将上述富集培养液以十倍稀释到不同浓度，各取0．5mL，涂布于平板分离培养基，32℃倒置培养。

3、试管培养：

从分离平板上挑取具有红曲耀特征的单菌落转接到试管保藏培养基上，32℃培养。

4、麸皮曲培养（复筛）：

用无菌生理盐水洗下试管红曲耀孢子，移入装有20-30颗直径为4mm～5mm玻璃珠的三角瓶中，振荡30 min，孢子分散即可。用已灭菌后的帮有脱脂棉的漏斗过滤除去菌丝，制成孢子悬液，并用无菌生理盐水稀释，使孢子浓度为106个／mL。取2m1．该孢子悬液接种到50g麸皮曲培养基，34℃堆积培养，经20h，待大部分料上见到菌丝生长时，扣瓶1次，吸附瓶壁冷凝水，并将物料摊平，实时调节培养温度使品温保持在32℃，以后每天扣瓶3—4次，待菌丝变红时44℃风干备用。

3、高产酯化酶的红曲霉的诱变育种

（1）诱变

为了达到较好的诱变效果，得到发生大突变的菌体，采用物理化学诱变因子交替诱变处理，方法步骤如下：

1、紫外诱变

取107个/mL的孢子悬液5mL倒入无菌的小平皿中，在磁力搅拌下，用紫外灯照射不同时间，各取0．1mI．菌液进行适当稀释，涂麦芽汁平板，32℃，培养3d～4d，计算孢子存活率。取0.1mL诱变处理的菌液适当稀释后涂糟浸液分离平板，32℃一34℃培养3d～4d，挑出透明圈大的菌落地行复筛 [3]。

2、LiCI化学诱变：

量取制备好的孢子悬液lmL，稀释级数为105个／mL。再从中分别取出lmL涂布予加有不同剂量(150uL、200uL、250uL、300uL、350uL、400uL、450uL)的LiCl(1m mol／L)麦芽汁平板上，放入32℃培养箱5d[3]。

3、紫外与氯化锂复合诱变：

以上述紫外诱变的高产菌株为出发菌株，制成孢子悬液，取5mL加入平皿，在紫外灯下照射60s后，再从中分别取出lmL涂布于加有300uL的LiCl(1mol／L)麦芽汁平板上，放人32℃培养箱5d。

4、硫酸二乙酯(DES)诱变:

选择处理时间分别为0min、lOmin、20min、30min、40min、50min、60min,处理后终止诱变[3]。

5、亚硝酸处理：

选择处理时间分别为0min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，处理后终止诱变[3]。

（二）高产菌株的筛选

1、纸片法初筛

随着诱变代数的增加，有效产物难度不断提高，当发酵液中产物浓度相当高时，活性圈大小与产物浓度之间失去线性关系，掩盖了菌株的高产性能而被漏选，因此选用纸片法。具体方法：取1mL发酵液稀释于49mL无菌水中，取直径0.5cm的圆纸片，灭菌后覆盖于培养基表面，准确取稀释后的发酵液1uL在滤纸片上，32℃条件下培养24h，测量水解圈大小[4]。

2、摇瓶法复筛

初筛获得的菌株从斜面接入含50 mL基础培养基的250 mL摇瓶。200 rpm，32℃条件下培养24 h。离心收菌体。

4、试验结果与分析

（一）初筛结果

分别从烟红色大曲和紫红色大曲中筛选到3株和6株红曲霉菌株分别编号为3．021～3．029。

（二）麸皮曲培养复筛结果

初筛得到的9株红曲霉菌株在麸皮培养基上都能良好生长，成熟的麸曲成淡红色，具有典型的曲香味。测量总酯含量，测量方法：皂化法[5]。测量结果：3．021～3．029号菌株的总产酯分别为：25.12mg/mL，30.41mg/mL，8.81mg/mL，17.56mg/mL，28.15mg/mL，10.49mg/mL，58.63mg/mL，6.55mg/mL，21.82mg/mL。从上述结果可知初筛的9株红曲霉菌株制成麸曲后都有一定的酯化能力，且这9株红曲霉酯化能力不同，其中3．027菌株酯化能力最强，3．022和3．025菌株的酯化能力次之。3．021，3．024，3．029菌株也有一定的酯化能力，且酯化能力棚差不大，3．023，3．026，3．028菌株酯化能力很弱。确定选取3．027为出发菌株进行诱变处理，提高其酯化能力。

（三）诱变结果

以3．027菌株为出发菌株，用上述的方法进行诱变。测定其存活率，并制作试剂剂量-致死率曲线，选取致死率在85%～99%的区间来确定诱变剂的最适处理剂量，其最适剂量如下：紫外线照射时间选择60s～90s，LiCl处理量为0.3mol／L和0．35mol／L，硫酸二乙酯处理时间为40min～55min，亚硝酸处理时间为28min～40min。

对3．027菌株孢子用以上确定的诱变剂量进行处理，通过反复诱变和复合诱变，得到生长良好的菌株5株，进行传代培养，最后制成麸曲，进行酯化试验。经过诱变处理得到5株生长良好的菌株分别编号为3．027A-3．027E，结果显示 3．027A，3．027E与出发菌株相差不大，3．027C明显低与出发菌株。3．027B和3．027D高于出发菌株，其中3．027D高出出发菌株约3倍，其酯化能力很高，具有良好使用前景。

（四）菌株3．027D的稳定性研究

将菌株3．027D接种到斜面保藏培养基上,32℃培养8d，连续传代8次，并把每代培养成麸曲进行酯化试验，酯化试验：l％己酸20％乙醇溶液加入一定量的麸皮曲，35℃静置酯化7d。测总酯含量mg/100mL，实验表明菌株3．027D的遗传稳定，各代的酯化能力相当，经传代培养8代后，其酯化能力没有减弱，是良好工业生产菌株。

5、结束语

本试验从大曲中筛选到红曲霍9株，其中3．027菌株的酯化能力较高，以3．027菌株为出发菌株反复诱变得到5株生长良好的菌株，其中3．027D的酯化能力很高，是出发菌株的3倍，经传代试验证明，遗传稳定，有良好的应用前景。

参考文献 （小三号，黑体）

[1]刘兆玺，杜金华，傅茂润，等．红曲功能及其研究进展[J]．酿酒，2006，33(4)：70-72．

[2] 吴衍庸．红曲酯化酶新技术及在中国白酒上的应用[J]．酿酒科技，2004，6：29-32．

[3]施巧琴，吴松刚．工业微生物育种学(第二版)[M]．北京：科学出版社，2003，95-103．

[4]施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学（第三版)[M]. 北京：科学出版社，2010,117.

[5]刘念，常少健，李国红等．己酸乙酯专用酯化曲酯化条件的优化研究[J]．四川食品与发酵．2008，5：57-59．