微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程

1　范围

      本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。

      本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。

      对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。

2　规范性引用文件

      下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。  

      国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》

      GB 19489 实验室 生物安全通用要求

      科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件 自然科技资源共性描述规范（试行）

3　术语和定义

      下列术语和定义适用于本规范。

3.1　

      冷冻干燥 freeze-drying 

      将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。

3.2　

      液氮超低温保藏 preservation in liquid nitrogen

      液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196℃的液态氮，或在-150℃的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

3.3　

      -80℃低温冷冻保藏 preservation in -80℃

      将菌种保藏在-80℃冰箱中以减缓细胞的生理活动进行冷冻的一种保藏方法。

4　内容

4.1　微生物菌种的冷冻干燥保藏技术规程

4.1.1　好氧菌冷冻干燥管的制备

4.1.1.1　安瓿管准备

      安瓿管材料以中性玻璃为宜。清洗安瓿管时，先用2%盐酸浸泡过夜，自来水冲洗干净后，用蒸馏水浸泡至pH中性，干燥后、贴上标签，标上菌号及时间，加入脱脂棉塞后，121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

4.1.1.2　保护剂的选择和准备

      保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度及pH值，以及灭菌方法。如血清，可用过滤灭菌；牛奶要先脱脂，用离心方法去除上层油脂，一般在100℃间歇煮沸2-3次，每次10-30分钟，备用。

4.1.1.3　冻干样品的准备

      在最适宜的培养条件下将细胞培养至静止期或成熟期，进行纯度检查后（参见科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件《微生物菌种纯度检测技术规程》（试行）），与保护剂混合均匀，分装。微生物培养物浓度以细胞或孢子不少于108-1010个/ml为宜（以大肠杆菌为例，为了取得每毫升1010个活细胞菌液2毫升-2.5毫升，只需10毫升琼脂斜面两支）。采用较长的毛细滴管，直接滴入安瓿管底部，注意不要溅污上部管壁，每管分装量约0.1-0.2毫升，若是球形安瓿管，装量为半个球部。若是液体培养的微生物，应离心去除培养基，然后将培养物与保护剂混匀，再分装于安瓿管中。分装安瓿管时间尽量要短，最好在1-2小时内分装完毕并预冻。分装时应注意在无菌条件下操作。

4.1.1.4　预冻

      一般预冻2小时以上，温度达到-20℃到-35℃左右。

4.1.1.5　冷冻干燥

      采用冷冻干燥机进行冷冻干燥。

      将冷冻后的样品安瓿管置于冷冻干燥机的干燥箱内，开始冷冻干燥，时间一般为8-20小时。

      终止干燥时间应根据下列情况判断：

      ——  安瓿管内冻干物呈酥块状或松散片状

      ——  真空度接近空载时的最高值

      ——  样品温度与管外温度接近

      ——  选用1-2支对照管，其水份与菌悬液同量，视为干燥完结

      ——  选用一个安瓿管，装1-2%氯化钴，如变深兰色，可视为干燥完结

冷冻干燥完毕后，取出样品安瓿管置于干燥器内，备用。

4.1.1.6　真空封口及真空检验

      将安瓿管颈部用强火焰拉细，然后采用真空泵抽真空，在真空条件下将安瓿管颈部加热熔封。

      熔封后的干燥管可采用高频电火花真空测定仪测定真空度。

4.1.1.7　保藏

      安瓿管应低温避光保藏。

4.1.1.8　质量检查

      冷冻干燥后抽取若干支安瓿管进行各项指标检查，如存活率、生产能力、形态变异、杂菌污染等。

4.1.2　厌氧菌冷冻干燥管的制备

      主要程序与需氧菌操作相同

4.1.2.1　安瓿管准备

      参见4.1.1.1

4.1.2.2　保护剂的选择和准备

      保护剂使用前应在100℃的沸水中煮沸15分钟左右，脱气后放入冷水中急冷，除掉保护剂中的溶解氧。

4.1.2.3　冻干样品的准备

      参见4.1.1.3

4.1.2.4　预冻

      参见4.1.1.4

4.1.2.5　冷冻干燥

      参见4.1.1.5

4.1.2.6　真空封口及真空检验

      参见4.1.1.6

4.1.2.7　保藏

      参见4.1.1.7

4.1.2.8　质量检查

      参见4.1.1.8

4.1.3　冷冻干燥法适用范围

      适用于大多数细菌、放线菌、病毒、噬菌体、立克次体、霉菌和酵母等的保藏，但不适于霉菌的菌丝型、菇类、藻类和原虫等。

4.1.4　保藏周期

      不同微生物复苏周期不同，一般10年左右。

4.1.5　复苏方法

      ——  先用70%酒精棉花擦拭安瓿上部，

      ——  将安瓿管顶部烧热，

      ——  用无菌棉签沾冷水，在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下，敲下已开裂的安瓿管的顶端，

      ——  用无菌水或培养液溶解菌块，使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养。

4.2　微生物菌种低温冷冻保藏技术

4.2.1　液氮超低温保藏技术

4.2.1.1　安瓿管或冻存管的准备

      用圆底硼硅玻璃制品的安瓿管，或螺旋口的塑料冻存管。注意玻璃管不能有裂纹。将冻存管或安瓿管清洗干净， 121℃下高压灭菌15-20分钟，备用。

4.2.1.2　保护剂的准备

      保护剂种类要根据微生物类别选择。配制保护剂时，应注意其浓度，一般采用10-20%甘油。

4.2.1.3　微生物保藏物的准备

      微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用静止期或成熟期培养物。

      分装时注意应在无菌条件下操作。

      菌种的准备可采用下列几种方法：

      刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；

      接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与保护剂混合分装于冻存管内；

      将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5-10毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；

      在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。

4.2.1.4　预冻

      预冻时一般冷冻速度控制在以每分钟下降1℃为好、使样品冻结到-35℃。

目前常用的有三种控温方法：

      ——  程序控温降温法，应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。

      ——  分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，将安瓿管或塑料小管，先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降1-1.5℃。

      ——  对耐低温的微生物、可以直接放入气相或液相氮中。

4.2.1.5　保藏

      将安瓿管或塑料冻存管置于液氮罐中保藏。一般气相中温度为-150℃，液相中温度为-196℃。

4.2.1.6　保藏周期

      一般10年以上。

4.2.1.7　复苏方法

      从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置在38℃-40℃水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止，一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

4.2.1.8　适用范围

      各类微生物。

4.2.1.9　液氮保藏应注意事项

      ——  防止冻伤，操作注意安全，带面罩及皮手套

      ——  塑料冻存管一定要拧紧螺帽

      ——  运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮

      ——  注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息

      ——  防止安瓿1　安瓿管或冻存管的准备

      4.2.1.1

4.2.2.2　保护剂的准备

      参见微生物保藏物的准备

      参见4.2.1.3

4.2.2.4　冻结4.2.1.2

4.2.2.3参见　保藏

      将安瓿管或塑料冻存管置于-80℃冰箱中保藏。

4.2.2.5　保藏周期

      一般1-5年。

4.2.2.6　复苏方法管或塑料冻存管破裂爆炸，如液氮渗入管内，当从液氮容器取出时，液态氮体积膨胀约680倍，爆炸力很大，要特别小心

      ——  注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期补充液氮。

4.2.2　-80℃低温冷冻保藏  

4.2.2.

      从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38℃-40℃水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜的培养基上进行培养。

4.2.2.7　适用范围

      各类微生物。198

6