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    介绍一种改量的粪便细菌基因组DNA提取试验方法
    郑吉顺;周翔天;陈萌萌;刘艳艳;李家斌
    【摘要】目的观察改变细菌裂解温度对提取粪便细菌基因组DNA量和纯度的影响.方法收集10例肝硬化患者粪便,每例患者粪便等分成两份,再随机分成两组.采用QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒(国际通用粪便细菌基因组DNA提取试剂盒进行抽提,一组(A组按照试剂盒说明书温度要求进行粪便细菌基因组DNA提取,一组(B组对试剂盒细菌裂解温度改良后再进行提取.结果与按照试剂盒说明书温度进行提取组相比,改变细菌裂解温度后粪便基因组DNA提取量明显增高(P<0.05,而粪便基因组DNA提取纯度(OD260/280、OD260/230无明显变化(P>0.05.结论改变细菌裂解温度能明显提高粪便细菌基因组DNA提取量,而不改变粪便细菌基因组DNA的提取纯度.该方法可以解决因粪便采样量少导致粪便基因组DNA提取量不足的问题.
    【期刊名称】《安徽医药》【年(卷,期】2014(018001【总页数】4页(P52-55
    【关键词】粪便细菌;基因组DNA的量;基因组DNA的纯度;细菌裂解温度;QIAamp;DNA;Stool;Mini;Kit试剂盒【作者】郑吉顺;周翔天;陈萌萌;刘艳艳;李家斌
    【作者单位】安徽医科大学第三附属医院,安徽,合肥,230001;安徽医科大学第一附属医院感染科,安徽,合肥,230022;安徽医科大学第一附属医院感染科,安徽,合
    肥,230022;安徽医科大学第一附属医院感染科,安徽,合肥,230022;安徽医科大学第一附属医院感染科,安徽,合肥,230022【正文语种】中文

    人类肠道定植着一群十分复杂而又相对稳定的微生物，栖息的细菌大约有400多种，数量达1014个左右，形成一个极其复杂的微生态系统，对人类健康有重要影响。肠道微生态的变化对机体具有重要的意义与影响，肠道微生态尤其是优势菌群的研究正越来越受到人们的重视，成为当前研究的热点，由于肠道长度长，内镜下分段获取肠道菌群标本因具有有创性、难度大，费时费力等因素未能在临床开展，对粪便中的菌群进行分析，能间接反映肠道菌群情况有助于了解肠道微生态变化，已成为近年来了解肠道微生态变化的主要途径。鉴别粪便中细菌的方法有很多，常用的有：细菌学分离培养鉴定技术，生化试验鉴定，形态学鉴定和分析等[1]，这些方法需要大量的劳动和时间，并且有时不能鉴别种水平的细菌；常规PCR方法虽然被广泛用于肠道菌群的研究，但存在着不能定量等缺点。近年来研究者开始应用基于16SrDNA的分子生物学方法研究肠道菌群(实时荧光定量PCR技术，实时荧光定量PCR技术[2]是对常规PCR技术的革新，精确性高，检测速度快，特异性和可靠性强，减少了假阳性，用于肠道菌群的定量研究有其独特的优势，能使我们更加广泛和更加详细的分析肠道中优势菌和荧光原位杂交及培养等方法不能检测到的非优势菌，为理解肠道菌群与机体健康及疾病关系提供重要线索，而进行实时荧光定量PCR检测的关键是如何获得粪便中细菌基因组DNA。提取粪便基因组DNA方法很多[3-5]，QiaAmpDNAStoolMiniKit试剂盒是国内外常用试剂盒，我们在应用该试剂盒时发现，调整细菌裂解温度，能明显提高粪便细菌基因组DNA的量及质，现介绍如下。

    1材料与方法
    1.1主要试剂及仪器QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒(上海新睿生物工程有限公司，批号2005520；电热恒温水槽箱(上海精密实验设备有限公司，型号DK-8D；核酸浓度测定仪(NanoDrop®ND-1000，UV-VisSpectrophotometer，DE19810，USA。微量离心机(ThermoScientificHeraeusFresco17。电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司，型号FA2004N24391.2标本来源标本来源于我院2009年1月—2012年10月住院肝硬化患者(临床诊断符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学会，肝病学会联合修订的病毒性肝炎诊断标准，总计10例，男性9例，年龄45～55岁，女性1例，年龄50岁，平均年龄(47.5±3.5岁。所有患者均签署知情同意书，在采样前2周均未使用抗生素、胃肠动力药物、酸奶及其它微生态制剂史。1.3粪便细菌总基因组DNA的提取
    1.3.1粪便样本采集及前期处理粪便标本采集：清晨采集患者尾便于无菌容器中。将粪便搅匀后，用电子天枰称取400mg，每管200mg分装保存于-80℃待测。1.3.2A组(1从-80℃冰箱取出装有粪便的EP管中，置于冰上(在BufferASL加入之前，确保其不要融化；加入1.4mLBufferASL,持续涡旋震荡1min，直至样品平均分布成颗粒状；70℃温育10min。(214000rpm，离心1min；吸取1.2mL上清液转移到新的2mLEP管中，弃沉淀。(3加入1片InhibitEX，立即涡旋震荡1min至InhibitEX完全溶解，室温静置1min。(414000rpm，离心3min。(5将上清液转移到新的2mLEP管中，14000rpm，离心3min。(6吸取15μL蛋白酶K到新的2mLEB管中。(7将步骤5离心后的上清液转移到含有蛋白酶K的2mLEP管中。(8加200μLBufferAL涡旋震荡15s，70℃温育10min。(9加入200μL100%酒精，涡旋震荡混匀。(10安置QIAmpSpin
    Column于2mLEP管中，将上述液体转移到QIAmpSpinColumn中。(1114000rpm，离心1min，将QIAmpSpinColumn安置到新的2mLEP管中，丢弃含过滤液的2mLEP管。(12加入500μLBufferAW1，14000rpm，离心1min。将QIAmpSpinColumn转移到新的2mLEP管中。(13加入500μLBufferAW2，14000rpm，离心3min。再次将QIAmpSpinColumn转移到新的1.5mLEP管中，加入70μLBufferAE，室温静置1min，14000rpm，离心1min，弃QIAmpSpinColumn，收集1.5mLEP管中的洗脱液即为粪便基因组DNA，最终体积为70μL，-20℃冰箱保存备测。
    1.3.3B组(1从-80℃冰箱取出装有粪便的EP管中，置于冰上，加入1.4mLBufferASL,持续涡旋震荡1min，直至样品平均分布成颗粒状；100℃温育4min、87.5℃温育3min、65℃温育3min，涡旋震荡15s；(214000rpm，离心1min；吸取1.2mL上清液转移到新的2mLEP管中，弃沉淀。余步骤同“1.3.2(3～(13”，最终粪便基因组DNA总体积为70μL。
    1.3.4粪便基因组DNA浓度测定按照NanoDrop®ND-1000核酸浓度测定仪使用说明书指示，取1微升的粪便基因组DNA洗脱液，直接加样于检测区，分别记录DNA的浓度、OD260/280及OD260/230值。
    1.3.5统计学分析定量检测所得的粪便基因组DNA的浓度、OD260/280、OD260/230值以原始数据表示。采用SPSS16.0软件进行数据分析，两组间比较采用成组设计的t检验，P<0.05差异具有统计学意义。2结果
    粪便DNA提取浓度能反映粪便DNA提取量，A260/280、OD260/230比值是判断核酸纯度常用标准。我们的研究结果表明改变细菌裂解温度后粪便基因组DNA提取浓度明显增加，高于按照试剂盒说明书温度组，差异具有统计学意义(P<0.05；两组间比较，OD260/280与OD260/230比值无明显差异，不具有统
    计学意义(P>0.05。见表1。3讨论
    以粪便为标本提取细菌基因组DNA进行肠道微生态研究的关键是能否提取到高质量的粪便细菌基因组DNA[6-7]。自粪便细菌基因组DNA分析技术兴起后，国内外在这方面做出了巨大的成就，发展了多种粪便细菌基因组DNA提取方法，如酚/氯仿抽提法、冻融-CTAB法、CTAB-SDS法、试剂盒法等，充分证实了粪便细菌DNA分析的可行性。但由于提取机理及步骤的差异，所获得细菌基因组DNA含量及纯度各不相同。戴方伟等[8-10]对各种粪便基因组DAN提取方法比较研究表明改良法、试剂盒法具有操作简便、省时省力的优点，且提取的DNA浓度、纯度和提取率亦较高，但有关温度对DNA浓度、纯度和提取率的影响报道较少。表1改变细菌裂解温度对提取粪便细菌基因组DNA量及纯度的影响注：DNA浓度组B组与A组比较#P=0.0033，t=3.390；OD260/280值B组与A组比较★P=0.3727，t=0.9142；OD260/230值B组与A组比较▼P=0.1917，t=1.356。病例号DNA浓度/mg·L-1A组B组#OD260/280A组B组★OD260/230A组B组▼1186.2345.22.012.191.711.95291.7207.32.162.121.721.993160.7301.92.112.111.531.624111.7163.62.162.111.331.545108.2194.61.891.991.201.38678.4138.92.122.211.331.307147.6245.92.092.051.391.64888.1132.2.102.131.291.379109.6199.92.112.101.311.291069117.92.152.200.941.21郑维[11]等研究表明，将细菌裂解温度定为100℃，裂解时间定为2～6min能明显提高粪便细菌基因组DNA提取量，无论是革兰阴性菌及阳性菌都可以得到高浓度的染色体DNA。QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒有着较好的通用性，其提取的DNA浓度、纯度提取率均较高，能符合分子生物学研究的基本要求[12]。我们在应用中发现改变该试剂盒细菌裂解温度后能明显提高粪便细菌基因组DNA
    提取浓度，这与郑维等的研究结果相符，分析原因考虑与肠道中同时存在革兰阴性菌及阳性菌，短暂高温加热能加速某些难裂解的革兰阳性菌细胞壁破碎，其基因组DNA释放有关及革兰阴性菌细菌裂解增加等因素有关，从而提高细菌裂解率及基因组DNA提取率[11,13]。
    一般来说OD260代表核酸的吸光度,OD280代表蛋白质的吸光度,OD230代表其他杂质(多糖等的吸光度。OD260/280比值是判断核酸纯度常用标准，纯化DNA其OD260/280在1.6～1.8之间，低于此范围表明蛋白质含量超标或酚等污染，高于此范围表明样品中含有RNA。我们比较发现两种方法OD260/280值均超过2.0，差异无显著性，这提示两种提取方法均不能有效去除RNA污染；干净的核酸OD260/230应该在2左右，我们发现两组粪便提取的细菌DNAOD260/230比值均低于2.0，差异无显著性，表明抽提的基因组DNA中存在污染-有酚盐离子等有机化合物存在。上述纯度测量结果表明两种提取方法均存在局限性，如何提高提取细菌基因组DNA纯度有待进一步探讨。由于两种方法提取机理相同，尽管提取细菌基因组DNA含量不同，但纯度相同，不影响后续的实验过程如PCR扩增、DNA测序等。
    进行肠道微生态研究，可能存在排便量少而无法采集到足够粪样。陶新[14]等发现UNIQ-10柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒能解决少量粪便细菌总基因组DNA的抽取。我们发现通过调整细菌裂解温度、提高细菌裂解率、增加粪便细菌基因组DNA的提取量可能有助于解决粪便采样量少难题，值得进一步研究。
    上述研究结果表明，改变细菌裂解温度，能提高粪便细菌基因组DNA提取量，不影响提取纯度，对后续的DNA相关实验影响不大；另外，对于采样困难，通过改良QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒细菌裂解温度，提高细菌裂解率可能是一种有效解决办法。参考文献:


    【相关文献】
    [1]孙茂华，孟祥升，夏兴霞，等.大肠杆菌O157∶H7实验感染动物排菌动态检测[J].东南国防医药，2012，14(1：5-8.[2]何金花，黎毓光，张鹏，等.原花青素联合ApollonsiRNA抑制肝癌HepG-2细胞增殖及凋亡[J].安徽医药，2013，17(4：552-555.[3]戴方伟，宋晓明，周莎桑，等.大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取方法的比较[J].中国实验动物学报，2011，19(3：246-249.[4]梁金花，杨景云，张虎，等.两种提取肠道微生物总DNA方法的比较[J].中国微生态学杂志，2010，22(5：477-478.[5]宋美茹，姚萍，张跃新.QIAamp及Biomed粪便细菌基因组DNA提取试剂盒提取人肠道细菌基因组DNA质量的差异[J].中国组织工程研究，2012，16(11：2015-2018.[6]ThakuriaD，SchmidtO，LiliensiekAK，etal.FieldpreservationandDNAextractionmethodsforintestinalmicrobialdiversityanalysisinearthworms[J].JMicrobiolMethods，2009，76(3：226-233.[7]HuijsmansCJ，DamenJ，VanDerLindenJC，etal.ComparativeanalysisoffourmethodstoextractDNAfromparaffin-embeddedtissues:effectondownstreammolecularapplications[J].BMCResNotes，2010(3:239.[8]戴方伟,宋晓明,周莎桑,等.大鼠肠内容物细菌基因组DNA提取方法的比较[J].中国实验动物学报,2011,19(3:246-249.[9]赵梅珍,刘晖,贺莉芳,等.三种试剂盒提取粪便隐孢子虫微量DNA的效果比较[J].安徽农业科学,2011,39(26:16130-16131.[10]刘虎虎,卢向阳,李亚丹,等.牛粪便微生物总DNA提取方法的优化[J].怀化学院学报,2011,30(5:38-41.[11]郑维，权春善，朴永哲，等.一种快速提取细菌总DNA的方法研究[J].中国生物工程杂志，2006，26(4：75-80.[12]吴仲文，韩樱，李兰娟,等.粪便DNA抽提方法的比较研究[J].中华检验医学杂志，2007，30(1：67-71.[13]ChenH，RangasamyM，TanSY，etal.EvaluationoffivemethodsfortotalDNAextractionfromwesterncornrootwormbeetles[J].PloSOne，2010，5(8：e11963.[14]陶新，徐子伟，刘敏华，等.少量动物粪便细菌总DNA提取方法的研究[J].中国畜牧杂志,2009,45(23:68-70.

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