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RNA提取步骤及注意事项

时间：2023-01-14 22:37:12 下载该word文档

RNA分离纯化的原理、提取步骤及注意事项一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时，常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学的成败。Trizol是一种新型总RNA提取试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。二、需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、1.5mlEP管（无RNase）、枪头（无RNase）、异丙醇、水（DEPC处理）低温离心机三、提取步骤1、从组织中提取总RNA①液氮研磨。组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，转入离心管进行第二步操作。②匀浆。组织样品按50-100mg组织/mlTrizol加入Trizol，另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
2、从细胞中提取总RNA①培养贴壁细胞：不需消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，操作步骤：吸尽培养液，用PBS洗涤细胞2-3次，按10cm2/mlTrizol比例加入Trizol，吹打，使细胞充分裂解。②对于悬浮细胞，可直接收集、裂解，每mlTrizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。操作步骤：收集细胞，600g离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞2-3次。③细胞或组织加入Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。（此时可放入-70℃长期保存。④12000rpm离心5min，弃沉淀，上清吸入到另一个RNase-free的EP管中，按200μL氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。（禁用涡旋振荡器，以免基因组DNA断裂）。⑤4℃，12000rpm离心15min，吸取上层水相，至另一个离心管中（RNase-free）（千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相保存于4℃冰箱，如只提取RNA，则弃下层酚相。⑥按0.5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇，混匀，室温放置5-10min。4℃，13000rpm离心15min，弃上清，RNA沉于管底。⑦按1ml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管（或用枪头吹打），悬浮

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