检验报告

实验名称： 菌落总数的检验

实验方法：平板计数法

商品名称：夸夸唔、有友、奇爽、乐棒棒、香猪脆、香脆肚。

参照标准：GB4789-17 2011

总负责人：熊经理

检验人员:徐恒琴、艳霞、游惠

检验时间： 2011年7月26—8月6号

2011年8月8日

菌落总数的检测

平板计数法

1、实验目的

为了进一步了解与熟悉我们产品的操作规和关键点的控制，掌握菌落总数的检验方法和了解超净工作台的操作规。

2、实验仪器设备和所需试剂及试剂的配制。

1、实验仪器及设备

杀菌锅YXQ—LS—SU 编号5090、无菌超净工作台SW—CJ—IC 编号24、JJ-Z型组织捣碎机、隔水或智能恒温培养箱GHP—9080、 出厂编号13475、烘箱ZFD—5040(全自动型鼓风干燥箱）、蒸馏水制备机、灭菌过的250ml锥形瓶、1ml吸量管、10ml的吸量管、酒精灯、锥形瓶1000ml、培养皿、电子天平AL104、电磁炉、锅、锅铲、PH试纸、恒温水浴锅HH—4 出厂标号160.53。

2、试验试剂及配制

2.1主要试剂：琼脂、无菌生理盐水、无菌水、75%的酒精、1moL/L氢氧化钠、1moL/L的盐酸。

2.2药品试剂

2.21琼脂：准确称取12.5g胰蛋白胨、酵母浸膏7.5g、葡萄糖3.0g、琼脂37.5g、蒸馏水2500ml，加入至锅中煮沸溶解，先加入琼脂将其熬化，在加入其它样品，直至样品熬化即可关掉火，冷却后调解PH值（7.0左右即可）。酸性用氢氧化钠调节、碱性用盐酸进行调节，将在1200C高压灭菌15min即可。

2.22无菌生理盐水：准确称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中。

2.23无菌水：吸取1000ml的蒸馏水，将在1200C高压灭菌15min即可。

2.24 1moL/L氢氧化钠：称取40g的氢氧化钠溶于1000ml的蒸馏水中在1200C高压灭菌15min即可。

2.45 75%的酒精：分别吸取400ml的95%的无水乙醇和100ml的蒸馏水与500ml的容量瓶中。

2.46 1moL/LDE 盐酸：移取浓盐酸90ml，用蒸馏水稀释至1000ml，在1200C高压灭菌15min即可。

3．试验步骤

1 、样品的稀释

1.1固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 ml 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。

1.2液体样品：以无菌吸管吸取25 ml样品置盛有225 ml 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。36 ℃±1 ℃ 48 h±2 h.

2、检样与接种：25 g(ml)样品+225 ml稀释液，均质，10 倍系列稀释选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液，各取1 ml 分别加入无菌培养皿。

2.1 用1 ml 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 ml，沿管壁缓慢注于盛有9 ml 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。

2.2.按上述操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 ml无菌吸管或吸头。

12.2. 根据对样品污染状况的估计，选择2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，吸取1 ml 样品匀液于无菌平皿，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取1 ml空白稀释液加入两个无菌平皿作空白对照。

3、倒平板：在酒精灯开着的条件下进行到培养皿的3分之一即可，而其中琼脂的温度需要在46℃即可倒入琼脂，不然会影响其细菌的生长繁殖。平板计数琼脂培养基，混匀.

4、培养：待琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h。水产品30 ℃±1 ℃培养72 h±3 h。如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 ml），凝固后翻转平板，

5、报 告

6.菌落计数

可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units，CFU）表示。

6. 1 选取菌落数在30 CFU～300 CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30 CFU 的平板记录具体菌落数，大于300 CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

6. 2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。

6. 3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

7 结果与报告

7.1 菌落总数的计算方法

7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数围时，按公式（1）计算：

N=∑C/(N1+0.1n2)d …………………………（1）

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

上述数据按7.2.2数字修约后，表示为25000或2.5×104。

7.1.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可

记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

7.1.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.1.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。

7.1.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

7.2 菌落总数的报告

7.2.1 菌落数小于100 CFU 时，按“四舍五入”原则修约，以整数报告。

7.2.2 菌落数大于或等于100 CFU 时，第3 位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前2 位数字，后面用0 代替位数；也可用10 的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

7.2.3 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。

7.2.4 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

7.2.5 称重取样以CFU/g 为单位报告，体积取样以CFU/mL 为单位报告。

4、数据处理及结果计算

1、乐棒棒菌落总数的数据分析

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

所以： N=37+38+39/3×10

N=380个/g

2、奇爽菌落总数的数据分析

若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数围时，按公式（1）计算：

N=∑C/(N1+0.1n2)d …………………………（1）

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

N=267+281+295+44+34+29/(3+0.1×3）×10

N=2879个/g

3、香猪脆菌落总数的数据分析

结果1

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

所以： N=57+60+34/3×10

N= 503个/g

结果2

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

所以： N=36+35+12/3×10

N=243个/g

4、夸夸唔菌落总数的数据分析

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

所以： N=53+118+84/3×100

N= 8500

5、有友菌落总数的数据分析

只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数围，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（ml）样品中菌落总数结果。

所以： N=1+7+3/3×10

N=33个/g

6、香脆肚菌落总数的数据分析

若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数围时，按公式（1）计算：

N=∑C/(N1+0.1n2)d …………………………（1）

式中：

N——样品中菌落数；

ΣC——平板（含适宜围菌落数的平板）菌落数之和；

n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

N=158+121+136+43+47+55/【3+0.1×3】×10-1

N=16969

5、数据分析。

通过一系列的实验论证表明：自己的贴牌产品的菌落总数含量较高，而其中香脆肚的菌落总数的含量更高，而泡椒风爪的菌落总数都控制的都较好。因此，在以后的生产过程中药控制好贴牌产品的环境和杀菌效果。菌落总数对环境的要求较高需要在无菌的条件下进行，以免被污染。在倒平板时要注意琼脂的温度，温度控制在46℃左右。还有在放入培养箱之前要将凝固好的琼脂倒置，以免水蒸气影响其结果。