2.2.5 金黄色葡萄球菌的相关表型实验方法

2.2.5.1 生长曲线的测定

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，接种至含有 1

ml TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2） 1:100 将菌转接入含有 50 ml TSB， MH 或 PN 培养基的 250 ml 烧瓶中，

37 ℃震荡培养（转速 220 RPM）。

（3） 每小时测量各瓶 OD600 数值，至细菌进入稳定期数值基本不再改变（约

12 小时） 。

2.2.5.2 自溶实验

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至 TSB 培养

基中，于 37 ℃振荡培养至指数中期。

（2）离心 10 min，回收细胞。

（3）用 PBS 洗细胞，重复三次。

（4） 将细胞重悬于等量含有 0.05% （W/V） Triton X-100 的 Tris-HCl （pH 7.5）

缓冲液中。

（5）将细胞重悬液于 30 ℃振荡培养（转速 220 RPM）。

（6）从测量零时开始，每隔 30 min 测量 OD600 的值，直到 OD 值降到初始

值的一半以下。

2.2.5.3 生物膜实验

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有 1 ml

TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2）将过夜培养的金葡菌按照 1:100 的接种量接种至新鲜 TSB 培养基，混

匀。

（3）将混合接种物分装至 96 孔板（Costar 3599） ，每孔 200 l 或者 24 孔板

（Costar 3524） ，每孔 1000 l。在 37 ℃恒温箱静置培养。

（4）培养一定时间后，取出孔板，弃掉上清，并用水轻柔地洗孔板三次。

（5）每孔加入 100 l（96 孔板）或 500 l（24 孔板）结晶紫染色液，常温

下静置 15 min 染色。

（6）弃掉结晶紫染色液，用水轻柔地洗孔板三次，吹干。

（7）拍照，用酶标仪检测 OD560 度数。

2.2.5.4 alpha 溶血素检测

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有 1 ml

TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2）测量 OD600 并将不同的菌株调整至 OD600 一致。

（3）在羊血平板上分别滴上 1 l 金葡菌培养物，在 37 ℃恒温箱静置培养

24 小时。

（4）观察菌落周围血细胞被溶解后形成的透明环，拍照。

2.2.5.5 胞外蛋白酶实验

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有 1 ml

TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2）测量 OD600 并将不同的菌株调整至 OD600 一致。

（3）在牛奶平板上分别滴上 1 l 金葡菌培养物，在 37 ℃恒温箱静置培养

24 小时。

（4）观察菌落周围牛奶蛋白被溶解后形成的透明环，拍照。

2.2.5.6 万古霉素敏感性实验

平板试验：

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有 1 ml

TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2）测量 OD600 并调整至 CFU 约 10

7

个/ml（约 OD600=0.05） 。

（3）1:10 梯度稀释，并分别涂布置含有不同浓度万古霉素的 MH 平板。

（4）37 ℃恒温箱静置培养 24 小时。

（5）观察并计数。

液体实验：

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有 1 ml

TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2）测量 OD600 并调整接种至 10 ml MH 培养基，CFU 约 10

7

个/ml。

（3） 每小时测量各瓶 OD600 数值，至细菌进入稳定期数值基本不再改变（约

12 小时） 。

2.2.5.7 葡萄糖-6-磷酸诱导实验

（1）从 37 ℃培养 16-20 小时的新鲜平板中挑取单菌落，接种至含有 1 ml

TSB 的 10 ml 培养管中。于 37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）过夜。

（2）离心收集，用无菌 PBS 清洗三次，调整至 OD600=1.0。

（3）1:100 接种至 PN 培养基，37 ℃振荡培养（转速 220 RPM）6 小时。

（4）向培养物中添加葡萄糖-6-磷酸至终浓度 5 g/L，继续培养。

（5） 在不同时间点分别收集 1 ml 菌液（添加前 0 min， 添加后 1 min， 5 min，

30 min） ，抽提 RNA。

2.2.5.8 金黄色葡萄球菌上清 AI-2 浓度检测

（1）收集菌液上清。将 1:100 接种的金葡菌每隔固定时间测量 OD600 的值

并取 200 l 菌液，4 ℃离心取上清，保存至-80 ℃待用。

（2）将上清化冻后，分别加样至专用发光检测 96 孔板，每孔 20 l。

（3） 将过夜培养的弧菌 BB170 根据发光强度 1:5000 到 1:10000 稀释， 分装

至发光检测板，每孔 180 l。

（4）在 30 ℃振荡培养，定时使用 Veritas 发光检测仪检测发光强度。

（5）对照组发光强度-时间曲线会出现“V”型曲线，取曲线最低点附近，

测量组与对照组发光强度的比值，即可表征 AI-2 浓度