实验三 显微镜的使用及细菌的形态观察

一、实验目的

1.学习微生物涂片、染色的基本技术；

2.学习并掌握细菌简单染色法的原理和步骤；

3.初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法。

二、实验原理

细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。

简单染色

普通染色 抗酸染色

正染色法 复杂染色

细菌的染色 革兰氏染色

特殊染色（芽孢染色法、荚膜染色法、细胞壁染色法）

负染色法

简单染色法就是利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。

常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。

当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。

染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌，固定细胞结构；二是使菌体牢固地粘附于玻片上；三是增加其对染料的亲和力（因为死的细胞膜选择透性被破坏，死的原生质更易于着色）。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。

三、实验材料与用品

显微镜 酒精灯 载玻片 吸水纸 擦镜纸 接种环 镊子 70%酒精酒精棉球 洗瓶 废液桶 水 结晶紫染液 液体石蜡（香柏油）

菌种：枯草杆菌固体斜面培养物 葡萄球菌固体斜面培养物

液体石蜡取代香柏油：香柏油的聚光性好，但附着能力极强，用完后不易擦掉，（需要用二甲苯（有机溶剂）擦拭，然后再用擦镜纸将二甲苯擦净（若擦不净，就会把镜头中的胶溶解））

四、实验步骤

1.涂片

用镊子取一干净的载玻片，用纱布擦拭干净，在酒精灯上方烤一下。然后在玻片两端各滴一小滴水，再采用无菌操作方法用接种环分别从枯草杆菌、葡萄球菌斜面上挑取少许菌种于水滴中，调匀并涂成薄膜。注意水滴不宜过大，取菌不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。

2.干燥

室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。

3.火焰固定

涂面向上，于火焰上通过2-3次，使细胞质凝固，以固定细菌形态，并使其不易脱落。如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。

4.染色

将玻片平放于桌面上，用滴管滴加结晶紫染液于涂片薄膜上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。染色时间为1min。

5.水洗

染色时间到后，倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。注意：冲洗时，水流不宜过急、过大，不要直接冲洗涂面，以免涂片薄膜脱落。

6.干燥

自然干燥或用吸水纸吸干（注意勿擦去菌体）。

7.镜检

用油镜观察并绘出细菌形态图（低倍镜→高倍镜→油镜）。注意：涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。

1） 在低倍镜和高倍镜下找到所要观察的细菌后，用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。

2） 在玻片标本的镜检部位滴一滴液体石蜡。

3） 从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在液体石蜡中，其镜头几乎与标本相接（应特别注意镜头不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不但压碎玻片，也会损坏镜头）。

4） 从目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用细调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止。如油镜已离开油面仍不见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。

5） 观察完毕，上旋镜筒。用擦镜纸将镜头擦拭干净。切勿用手或其他纸擦拭镜头，以免损坏镜头。

6） 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞。

五、实验结果

绘制单染色后观察到的枯草杆菌和葡萄球菌的形态图，并写明菌种名称及放大倍数（物镜放大倍数×目镜放大倍数）。