时间:2018-10-25 下载该word文档
生物技术实验心得体会
基因克隆技术是分子生物学的核心技术,其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝,用于深入分析基因的结构与功能,并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。本论文主要从以下几个方面来介绍基因克隆技术:目的基因的获得 、目的基因和载体的连接、重组分子的扩增和鉴定。 可概括为∶分、切、连、转、选。“分”是指分离制备合格的待操作的DNA,包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA“;切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA,或者切出目的基因;“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来,形成重组的DNA分子;“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增;“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。基因克隆技术包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接,构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中去表达,从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
一. 目的基因的获得
目的基因是指所要研究或应用的基因,也就是将要克隆或表达的基因。获得目的基因是分子克隆过程中最重要的一步。基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,。所需目的基因的来源, 不外乎是分离自然存在的基因或人工合
成基因。常用的方法有PCR 法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选 PCR方法
PCR 是一种在体外快速扩增特定基因或DNA。聚合酶链式反应是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。
化学合成法制备基因片段
采用DNA合成仪,对目的基因进行分段合成,然后进行连接,可以得到所需的目的基因。 二、 重组质粒的构建
DNA体外重组是将目的基因在DNA连接酶作用下,连接到合适的载体DNA上,以便下一步转化之用。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2 、ATP存在的连接缓冲 系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12~16℃,连接12~16h,这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。
三、重组分子的扩增和鉴定 重组DNA分子导入受体细胞
目的基因和载体在体外连接形成重组DNA分子后,需要被导入受体细胞中才能进行增殖和表达。受体细胞是重组基因增殖的场所,所以对受体细胞也应具有几点要求:①容易接纳重组DNA分子;②对载体的复制扩增无严格限制;③不存在特异的能降解外源DNA的内切酶体;④不对外源DNA进行修饰。一般将重组DNA分子导入原核细胞的过程称为转化,而导入真核细胞的过程称为转染。将重组DNA分子和感受态大肠杆菌细胞相混合,使重组DNA分子进入大肠杆菌中,就可以实现重组DNA分子的转化。 重组DNA分子的鉴定
重组DNA分子导入受体细胞后是否得到扩增,扩增后的重组DNA分子是否正确,导入的重组DNA分子是否含有正确的插入片段,重组DNA分子能否表达插入的目的基因,一般可以采用X-gal筛选的方法对重组DNA分子进行鉴定。 四、实验中的注意事项
1、大肠杆菌液体培养基和固体筛选培养基制备: 1 接种过程中,试管或三角瓶口等,也可通过火焰灼烧灭菌。
2 培养基、橡胶制品、塑料制品等不能使用干热灭菌。 3 在加热过程中应不断搅拌,以防琼脂粉沉淀糊底烧
焦,并应控制火力,以免培养基起泡而溢出容器。 4 注意培养基分装时避免其沾污三角瓶口、试管口。 5 严格按照高压蒸汽灭菌的灭菌指标对培养基、器皿灭菌,确保灭菌彻底。
2、大肠杆菌工程菌平板培养:
1 划线分离时,挑菌量要小,严格无菌操作,避免环境中的杂菌污染。
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