金线莲组织培养方法

一种药用金线莲组织培养快速繁殖方法，其特征在于包括如下步骤：　　　　１）培养基准备　　　　该步骤包括配制，分装，灭菌三步，其中　　　　配制：以１／２ＭＳ为基本培养基，每升添加６－苄氨基嘌呤２ｍｇ、α－萘乙酸１．０～１．５ｍｇ、芸苔素内酯０．０５ｍｇ、香蕉１００ｇ、琼脂６．５ｇ和蔗糖２５ｇ，混合后的培养基的ｐＨ值调节至５．６；　　　　分装：将配制后的培养基加热至琼脂完全溶解，趁热均匀地分装于干净的培养瓶中，稍凉后加盖；　　　　灭菌：将加入培养基的培养瓶及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：１２１℃、１０５ｋＰａ下灭菌１５分钟，灭菌后及时取出培养瓶，冷却备用；　　　　２）外植体处理和接种　　　　该步骤分为两种情形，当采用自然生长的植株作为外植体时包括清洗，消毒，接种三步，其中　　　　清洗：选择自然生长、无病虫害的健壮植株，用加入少许肥皂粉的水清洗植株，后用流水冲洗２小时；　　　　消毒：在无菌条件下，去除叶片，将植株茎段在７５％的酒精中浸润１０秒后，放入１０％的次氯酸钠消毒１５分钟，用无菌水清洗６遍，沥干水分，放入无菌的培养皿中备用；　　　　接种：将消毒后备用的茎在无菌条件下切成长约１ｃｍ、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接１个茎段；　　　　当采用组培无菌苗时直接进行无菌接种，即在无菌条件下将组培无菌苗去叶，将茎切成长约１ｃｍ、含一个茎节的若干茎段，接种于准备好的培养基上，每瓶接１个茎段；　　　　３）培养　　　　该步骤将接好种的培养瓶移入培养室进行幼苗的诱导与培养，培养条件为：温度２５±２℃，光照时间每天１２小时，光照强度１５００～２０００ｌｘ，培养时间四个月左右，培养期间要勤检查，发现污染的要及时去除；　　　　４）移栽　　　　选苗高约６～８ｃｍ、具叶３张以上、茎基直径约２ｍｍ、发根２～３条的试管苗，炼苗４天后，洗净附着在植株上的培养基，并晾干洗涤水后移栽至１份菜园土＋２份粗砂＋１份木屑，或１份菜园土＋１份粗砂＋２份木屑的基质中。

2一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，采用小菇属4种真菌：石斛小菇(Mycena dendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、兰小菇(Mycena orchidicola)、开唇兰小菇(Mycena anoectochila)中的任选一种或由其中任意两种或两种以上组成，其主要步骤及条件如下(所述比例均为重量百分比)： (1)菌根真菌的培养将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12-20d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵或接入固体培养基进行培养； (2)金线莲苗的培养芽增殖培养基：MS(Murashige and Skoog 1968)培养基，附加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；丛芽增殖培养基：MS为基本培养基，附加6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；苗继代培养基：1/2MS，200g/L马铃薯提取液，25g/L蔗糖，琼脂9g/L，pH5.8； (3)菌根真菌与金线莲苗共生栽培 (a)金线莲栽培基质蛭石∶砂子＝4∶1或森林腐殖土∶砂子＝6∶1或泥炭土∶砂子＝5∶1或泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2； (b)金线莲菌根共生栽培在硬质材料的托盘或盆中立体栽培，其容器的基部平铺一层金线莲栽培基质，其上按株行距栽培一株或一丛的金线莲苗，在苗根的基部放置少量粉碎的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1-2g，使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗覆盖2-3厘米厚，浇放置至室温的水； (c)栽培条件采用塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，照度2000Lx； (d)金线莲的收获收获时可剪取地上部分，也可一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干；其中所述的菌根真菌的液体培养为：培养基的配制：葡萄糖2.5％；KH2PO4 0.15％；K2HPO4 0.1％；MgSO4 0.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)，高压灭菌后分别接入上述真菌；培养条件：培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；23℃培养30天；发酵罐培养接种量10％，其余参数同上；发酵培养结束时将发酵物用匀浆机打碎菌体及发酵物备用；其中所述的菌根真菌的固体培养为：培养基的配制：阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％，高压灭菌后分别接入上述真菌，待菌丝从培养基顶部长入底部时取出备用。

3一种金线莲组培苗培养方法，其特征包括下列步骤：ａ）培养基配置：Ⅰ）培养基配方为：ＭＳ＋生长素＋细胞分裂素生长素：取自萘乙酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸中的一种或几种，含量为０．１－２ｍｇ／Ｌ；细胞分裂素：取自６－苄基氨基嘌呤、激动素、玉米素中的一种或几种，含量为０．１－２ｍｇ／Ｌ；Ⅱ）按Ⅰ）配方配置培养基，调节培养基ｐＨ值在５．６－５．８范围内，加入重量百分比８．８－９．０％的琼脂，常规高压灭菌；ｂ）选择野生金线莲茎段或茎尖为种源，灭菌后接种于按步骤ａ）配制的固体培养基中进行诱导培养，培养条件为：光照（５００－３０００１ｘ）１２小时／天，温度２０～２６℃；ｃ）经诱导形成的再生芽依次置于生长素和细胞分裂素浓度从高到低再到零的驯化培养基上进行培养，生长素和细胞分裂素浓度递减梯度为０．１～０．５ｍｇ／Ｌ，每个梯度培养３０～４０天，培养温度２０～２６℃，光照（５００－３０００１ｘ）１２小时／天，直至培养基中生长素与细胞分裂素浓度为０；ｄ）从步骤ｃ）的无激素培养基上选取生长快且健壮的组培苗进行继代培养。

4一种通过组织培养生产台湾金线莲的方法，它包括如下步骤：ａ、植物体的选择及无菌处理：选择６～８月份生长的的台湾金线莲野生植物，除去根和叶进行清洗和无菌处理，将茎段剪成０．５～１．５ｃｍ带茎节的台湾金线莲小段组织；ｂ、丛生芽诱导培养：将经过无菌处理后的台湾金线莲小段组织在诱导培养基中进行组织诱导培养丛生芽，培养周期：１０～６０天，培养温度：１０～３５℃，光照时间：０～２４小时／天，光照强度：０～１００μｍｏｌ／ｍ↑［２］.ｓ；所述的诱导培养基为：Ｈ培养基＋蔗糖１０～５０ｇ／Ｌ＋α－萘乙酸０．１～３．０ｍｇ／Ｌ＋６－苄氨基嘌呤０．１～５．０ｍｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．０～７．０；ｃ、大规模培养：将诱导出的丛生芽在大规模培养基中进行大规模培养，培养周期：１０～６０天，培养温度：１０～３５℃，光照时间：０～２４小时／天，光照强度：０～１００μｍｏｌ／ｍ↑［２］.ｓ；所述的大规模培养基为：Ｂ５培养基＋蔗糖１０～５０ｇ／Ｌ＋琼脂４～１０ｇ／Ｌ＋活性炭０．１～５．０ｇ／Ｌ＋α－萘乙酸０．１～３．０ｍｇ／Ｌ＋６－苄氨基嘌呤０．１～５．０ｍｇ／Ｌ，ｐＨ值为５．０～７．０。