小鼠脾脏单个核细胞分离及细胞计数

实验时间： 实验地点： 实验人：

1实验原理

小鼠脾脏位于上腹部左后侧，体积较大，长条形，属于外周免疫器官。

外周血中淋巴细胞可经再循环驻如脾脏等外周免疫器官的特定区域， 所以富含各

类免疫细胞。

免疫细胞的分离：采用红细胞裂解法，是根据细胞对渗透压变化的敏感度。

红细胞由于细胞结构较为简单，仅有细胞膜结构，对于膨胀的耐受能力较差，因 此绝大部分就会涨破，受到破坏。是一种比较温和的去除红细胞最简便易行的方 法。

2实验材料：

1） 健康小鼠

2） 手术器械（剪刀、镊子）、解剖板

3） 70汇醇

4） PBS缓冲液、红细胞裂解液（ACK

5） 0.2%台盼蓝

6） 细胞计数板、计数器

7） 离心机

8） 显微镜

3实验方法：

3.1取小鼠脾脏

将小鼠颈椎脱位处死，用酒精消毒。

用剪刀剪开背部皮肤，再找到脾脏，用镊子夹出脾脏并剪除周围组织。

3.2制备单个核细胞悬液

将取出的脾脏置于盛有3mlPBS缓冲液的平皿中，然后再置于尼龙指套中，用

针芯轻轻碾压使得单个核细胞悬浮于平皿中。

吸取平皿中细胞悬液置于刻度离心管（15ml）中，以1500rpm离心10min, 弃去上清液，加入ASK至 2-3ml，轻轻吹打混匀并放置2min,以破坏红细胞。 然后加入PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心10min。

弃去上清液，用PBS缓冲液定容至2ml，吹打混匀即为小鼠脾脏单个核细胞 悬液。

3.3计算细胞浓度

稀释十倍，随机选取一个大方格计数

细胞计数为324个，计算细胞浓度为324X 104 X 10=3.24 X 107/ml

3.4计算细胞活力

在总计为 324个细胞中计数，死亡细胞有 16 个，计算细胞活力为：

324- 16/324 X 100%=95.1%

在理论范围之内

4 实验结果

4.1研磨脾脏得到细胞悬液

本实验中将小鼠的脾脏放入尼龙指套内， 置于少量PBS液中缓慢研磨，获得 细胞悬液。 实验中， 我们发现尼龙指套不能滤去所有结缔组织， 操作中会有结为 絮状团块的结缔组织。 这些结缔组织在离心后会和细胞绞缠在一起， 去除十分麻 烦，而且会损失细胞。 应该在离心之前尽早用吸管吹打后小心弃去 （这样损失的 细胞比较少，造成较小的误差） 。

研磨脾脏时的力度、 时间、温度都会影响细胞的活性。 所以应置于冰上快速、 轻柔地研磨， 置于液体中避免干磨。 我们在实验室室温下碾磨， 造成细胞破碎较 多，影响最终实验结果。

4.2白细胞计数

在使用血球计数板时，遇到了镜下看不到计数板格子线的问题 : 起初，我们 小组能够在镜下观察到细胞， 但是细胞清晰时无法找到计数板格子线。 后来我们 意识到，这可能是因为充池后立即观察， 细胞还悬浮在液体中， 和方格线不在同 一个平面上。静置 2分钟后再调焦观察， 只能隐约看到方格线。 在反复调试中发 现，减小光圈并降低光源亮度可以增加方格线的清晰度。 另外，一定要注意在充 池前对计数板的清洁。 我们小组起初用卫生纸对计数板清洁， 在镜下发现残留很 多纸纤维，严重影响观察。改用擦镜纸清理后， 就大大减少了杂物对视野的影响。