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总DNA提取
1溶菌酶+蛋白酶K法:取500uL经预处理的菌悬液于1.5mL无菌离心管中,加20mg/mL溶菌酶25uL,37℃温浴,45min;再加入50uL,10%SDS和15uLl0mg/mL蛋白酶K,55℃水浴1h并适时摇动混匀;之后,再依次用等体积酚、苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1混合液、氯仿进行抽提,收集上清;再加入l/l0体积的3mol/L醋酸钠及2倍体积的预冷无水乙醇,混匀后予一20℃静置30min以上;离心弃上清,沉淀用75%乙醇洗涤、干燥;最后溶于l00uL无菌双蒸水中,并加入终浓度为20mg/mL的RNA酶A,37℃放置30min,然后于一20℃保存,备用。
2改进CTAB法:取500uL经预处理的菌悬液于1.5mL无菌离心管中,加入20mg/mL溶菌酶l2uL和1uLRNase(1mg/mL,冰浴1h,并间隔l0min混匀1次;取出置于一20℃下静置20min后,放人68℃中水浴10min,加入10%SDS53uL,继续于68℃下水浴l5min;接着加入5mol/LNaCl87uL,CTAB/NaCl(1%CTAB,0.73mol/LNaCl69uL再于68℃下水浴l5min;取出后,于一20℃下静置30min;之后,用等体积的氯仿/异戊醇(24:1进行抽提取上清,重复该步骤l次;然后加入1/l0体积的3mol/L醋酸钠及2倍体积的预冷的无水乙醇,并于一20℃静置30min,然后离心弃上清;沉淀用70%乙醇进行洗涤,干燥后,沉淀溶于100uL无菌双蒸水中并加入RNase使其终浓度为20ug/mL,于37℃消化30min,最后于-20℃保存,备用。
3试剂盒法:称取200m9粪便样品用于DNA提取,具体步骤见QIAampDNAStoolMiniKit试剂盒说明书。所得DNA溶于l00uL无菌双蒸水中,于-20℃保存。
4二氧化硅法:取500uL经预处理的菌悬液于l.5mL离心管中,加入10肚L裂解液(蛋白酶K10099;0.05mol/LEDTA400uL;1mol/LTris400tlLpH8