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    GC-MS衍生化法检测先天性畸形羊水中的非极性氨基酸

    时间：2023-11-11 16:33:32    下载该word文档
    ２０１７年７月　基础医学与临床　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｊｕｌｙ　２０１７　Ｖｏ１．３７　Ｎｏ．７　第３７卷第７期　文章编号：１００１—６３２５（２０１　７）０７—１００４—０６　ｘｏｌ－究论文　ＧＣ—ＭＳ衍生化法检测先天性畸形羊水中的非极性氨基酸　任利红　，刘　刚　，徐红兵　，罗　蓉　（重庆医科大学１．附属第一医院内分泌科；２．附属大学城医院妇产科；３．附属第一医院产科，重庆４０００１６）　摘要：目的利用气相色谱质谱（Ｇｃ—Ｍｓ）衍生化法对孕先天性畸形儿孕妇羊水中的非极性氨基酸，包括丙氨酸　（Ａｌａ）、亮氨酸（Ｌｅｕ）、异亮氨酸（Ｉｌｅ）、脯氨酸（Ｐｒｏ）和苯丙氨酸（Ｐｈｅ）进行定量检测；探讨疾病组与正常组孕妇羊水　中非极性氨基酸的差异及其意义。方法取１００　羊水上清液，加入甲醇去蛋白后提取上层清液吹干，进行　ＭＳＴＦＡ衍生化，利用ＧＣ—ＭＳ检测并分析检测结果。结果该方法具有良好的灵敏度、精密度、准确度以及回收率。　在最优化的检测条件下，被检测氨基酸最低检出限为０．１２—０．３８　ｍｇ／Ｌ，线性范围为０．５～１０　ｍｇ／Ｌ，添加回收率为　９１．１２％～１０４．４１％，日内及日间相对标准偏差（ＲＳＤ）为０．８４％～９．３３％。用建立的方法对１７例疾病组和１３名正　常组孕妇的羊水样本进行测定，统计分析结果表明，疾病组孕妇羊水中亮氨酸和异亮氨酸含量显著降低（Ｐ＜　０．０１），其余３种氨基酸水平无明显差异。结论本方法经方法学验证，可作为羊水中氨基酸含量的测定方法，具有　良好的应用前景；亮氨酸的减少可能参与了先天性畸形的发生。　关键词：先天性畸形；羊水；气相色谱一质谱；非极性氨基酸　中图分类号：Ｒ４４６．１９　Ｒ７１４．５３　文献标志码：Ａ　Ｑｕａｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｎｐｏｌａｒ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ｏｆ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ—ＭＳ）ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ＲＥＮ　Ｌｉ．ｈｏｎｇ　，ＬＩＵ　Ｇａｎｇ　，ＸＵ　Ｈｏｎｇ．ｂｉｎｇ　，ＬＵＯ　Ｒｏｎｇ　（１．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ；２．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ・Ｔｏｗｎ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ；　３．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ，ｔｈｅ　Ｆｉｒｓｔ　Ａｆｉｌｆｉａｔｅｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ　４０００１６，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：０ｂｊｅｃｔｉｖｅ　Ｔｏ　ｄｅｖｅｌｏｐ　ａ　ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣ－ＭＳ）ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｑｕａｎ－　ｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｏｎｐｏｌａｒ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ｏｆ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａｌａｎｉｎｅ（Ａｌａ），ｌｅｕ－　ｃｉｎｅ（Ｌｅｕ），ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（Ｉｌｅ），ｐｒｏｌｉｎｅ（Ｐｒｏ）ａｎｄ　ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ（Ｐｈｅ）．Ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ　ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｗｏｍｅｎ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅ－　ｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｆｔｅｒ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　１　００　ｔｘＬ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｏｆ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ｂｙ　ｍｅｔｈｙｌ　ａｌｃｏｈｏｌ，ｔｈｅ　ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ　ｗａｓ　ｄｒｉｅｄ　ｂｙ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭＳＴＦＡ　ｆｏｒ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｎ　ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｄｅｔｅｃｔ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｚｅ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｏ　ｈａｖｅ　ｇｏｏｄ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ，ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ａｃｃｕｒａｃｙ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ．Ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｔｅｓｔｉｎｇ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，　ｔｈｅ　ｌｉｍｉｔ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＬＯＤ）ｗａｓ　０．１２—０．３８　ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｃｕｒｖｅｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｇｏｏｄ　ｌｉｎｅａｒｉｔｙ　ｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｉｎ一　收稿日期：２０１７—０２—０９　修回日期：２０１７—０４—２６　基金项目：重庆市社会民生科技创新专项（ｃｓｔｃ２０１５ｓｈｍｓｚｘ１２００４０）　通信作者（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ａｕｔｈｏｒ）：ｌｕｏｒｏｎｇｙ＠１６３．ｃｏｎ　
    任利红ＧＣ．ＭＳ衍生化法检测先天性畸形羊水中的非极性氨基酸　１００５　ｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ　ｂｅｔｗｅｅｎ　０．５　ａｎｄ　１０　ｍｇ／Ｌ．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ｗｅｒｅ　９１．１２％ｔｏ　１０４．４１％．Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｒａ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒ－ｄａｙ　ｗａｓ　０．８４％ｔｏ　９．３３％．Ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ａｐｐｌｉｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉ—　ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　５　ｎｏｎｐｏｌａｒ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ａｍｎｉｏｔｉｆｃ　ｆｌｕｉｄ　ｏｆ　１　７　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｗｏｍｅｎ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　１　３　ｎｏｒｍａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｗｏｍａｎ．Ｔｈｅ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ａｎｄ　ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　ｄｅｃｒｅａｓｅｄ　ｉｎ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｇｒｏｕｐ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｃｏｎｔｒｏｌｓ．Ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ　ｈａｄ　ｎｏ　ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．　Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ　Ｔｈｅ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗａｓ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ａｍｎｉ—　ｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　ａｎｄ　ｈａｖｉｎｇ　ｂｒｏａｄ　ｐｒｏｓｐｅｃｔ　ｏｆ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｌｅｕｃｉｎｅ　ｍａｙ　ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃｏｎｇｅｎ—　ｉｔａｌ　ｍａｌｏｒｆｍａｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ；ｇａｓ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ；ｎｏｎｐｏｌａｒ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　先天性畸形是指胎儿在生长发育过程中，由于　多种致畸因素引起的胎儿形态结构上的异常及先天　性代谢缺陷¨』，包含的病种多，对患儿自身，家庭以　及社会造成沉重的负担。据报道，先天性畸形儿的　生物体液如尿液、血液以及脑脊液中氨基酸谱发生　了明显的改变　Ｊ。氨基酸是生物功能大分子蛋白　质的基本组成单位，参与了人体多条代谢通路　Ｊ，　与多种疾病的发病机制密切相关　。因此，测定先　天性畸形相关生物样本中的氨基酸含量具有重要的　超或染色体检查报告结果确认。收集在重庆医科大　学附属第一医院产科进行羊膜腔穿刺检查的产妇的　羊水样本。其中包括１７例孕先天性畸形胎儿的孕　妇，孕１５～２８周，年龄２４～４１岁，无血液、呼吸和消　化等其他器官系统疾病。年龄及孕周相匹配的正常　孕妇ｌ３名，其相关信息记录在表１。所有人组孕妇　均签署知情同意书，并且本研究已经通过伦理委员　会审核。收集的羊水样本３　５００　ｒ／ｍｉｎ离心１０　ｍｉｎ，　取其上清液，放于一８Ｏ℃保存备用。　１．２实验方法　临床意义。本文建立气相色谱质谱（ＧＣ－ＭＳ）衍生　化法对孕先天性畸形儿孕妇的羊水样本，进行非极　性氨基酸含量的检测，包括丙氨酸（Ａｌａ）、亮氨酸　１．２．１溶液的配置：５种氨基酸标准品用甲醇配　制成各自氨基酸储备液以及６个不同浓度的混　标溶液，储备液浓度为：丙氨酸（Ａｌａ）１　ｇ／Ｌ、亮氨　酸（Ｌｅｕ）１　ｇ／Ｌ、异亮氨基酸（Ｉｌｅ）１　ｇ／Ｌ、脯氨酸　（Ｐｒｏ）１　ｇ／Ｌ和苯丙氨酸（Ｐｈｅ）２　ｇ／Ｌ。混标溶液　中每个氨基酸的添加浓度分别为０．５×１０一ｇ／Ｌ、　１×１０一　ｇ／Ｌ、２ｘ１０一　ｇ／Ｌ、５×１０一　ｇ／Ｌ、７．５×１０一　ｇ／Ｌ　（Ｌｅｕ）、异亮氨酸（Ｉｌｅ）、脯氨酸（Ｐｒｏ）和苯丙氨酸　（Ｐｈｅ）；并探讨氨基酸含量的变化与疾病之间的　关系。　１材料与方法　１．１材料　和１０ｘ１０～ｇ／Ｌ。　１．１．１试剂：氨基酸标准品：丙氨酸（Ａｌａ）、亮氨　酸（Ｌｅｕ）、异亮氨酸（Ｉｌｅ）、脯氨酸（Ｐｒｏ）、苯丙氨酸　（Ｐｈｅ），双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（ＢＳＴＦＡ）　和Ｎ一甲基一Ｎ．（三甲基甲硅烷基）三氟乙酰胺　（ＭＳＴＦＡ）（Ｓｉｇｍａ—Ａｌｄｒｉｃｈ公司）；甲醇（ＴＥＤＩＡ公　司）。　１．２．２样本处理：取１００　ｔｚＬ不同浓度的混标溶液　于３７℃氮吹仪吹干，加人５０　衍生化试剂（ＭＳＴ—　ＦＡ），混匀３０　Ｓ，密封，在７０℃水浴箱反应６０　ｍｉｎ。　恢复至室温后，取１　Ｌ用于ＧＣ—ＭＳ进样分析。　羊水上清液于４℃解冻，各取１００　，加入　１　ｍＬ甲醇溶液沉淀蛋白（ｖ：ｖ为１：１０），将去蛋白的　羊水样本涡旋振荡混匀３０　Ｓ，然后于３　５００　ｒ／ｍｉｎ离　１．１．２样本收集：胎儿先天性畸形的诊断依靠Ｂ　表１孕妇的妊娠相关信息资料　Ｔａｂｌｅ　１　Ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｇｎａｎｔ　ｗｏｍｅｎ　ａｇｅ／ｙｅａｒｓ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｇｅｓｔａｔｉｏｎａｌ　ｗｅｅｋｓ　１８￣３（１５～２８）　ＢＭＶ（ｋｇ／ｍ　）　２３．７６￣１．９１　２４．２２￣２．５６　ｓａｍｐｌｅ　ｓｉｚｅ／ｎ　３０￣３（２４－４１）　３２￣４（２４－４１）　２０＋２（１４～３２）　
    １００６　基础医学与临床　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　实验比较了两种硅烷化试剂：ＢＳＴＦＡ和ＭＳＴＦＡ对　心１５　ｍｉｎ；取离心上清液，用３７℃氮吹仪吹干，加入　５０　衍生化试剂（ＭＳＴＦＡ），混匀３０　Ｓ，密封，在　７０　ｃＣＩ水浴箱反应６０　ｍｉｎ。恢复至室温后，取１　ＩｘＬ　用于ＧＣ－ＭＳ进样分析。　被检氨基酸的衍生化效果，确定衍生化试剂的选择；　衍生化时间的优化：在其他条件固定的情况下，用　５×１０　ｇ／Ｌ的混标溶液进行衍生化反应，衍生化时　间分别为４０、５０、６０、７Ｏ或８０　ｍｉｎ，每个时间下重复　进样３次；衍生化温度的优化：用５×１０　１．２．３气相色谱质谱条件的设置：色谱柱：ＤＢ一５　毛细管柱（３０　ｍｍ×０．２５　ｍｍ，０．２５　ｔｘｍ）；程序升　温：初始温度１Ｏ０℃保持３　ｍｉｎ，再以１５℃／ｍｉｎ　Ｌ混标溶　液，分别于６０、６５、７０、７５或８０℃温箱中衍生　升至２８０　保持１０　ｍｉｎ；进样口温度：２５０℃；　传输线温度：２８０　ｏＣ；载气：氦气，恒流模式；流　速：１．０　ｍＬ／ｍｉｎ。电子轰击源（ＥＩ）：电子能量　７０　ｅＶ；离子源温度：２３０℃；四级杆温度：１５０　ｏＣ；　扫描方式：选择离子扫描（ＳＩＭ）模式进行。５种　被检氨基酸的色谱图如图１所示，其保留时间、　分子质量和选择离子如表２所示。　表２各氨基酸的保留时间、分子质量和选择离子　Ｔａｂｌｅ　２　Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ＭＷ，ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｉｏｎｓ　ｏｆ　ＭＳＴＦＡ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｍｉｎｏ　ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｃｉｄｓ　ｔｉｍｅ／ｍｉｎ　Ｍｗ　／ｋｕ　ｉ。ｎｓ／ｆ【ｎ／ｚ）　Ａｌａ　４．４８　２３３　７３，１１６，１４７　Ｌｅｕ　４．９３　２７５　５７．７３．１５８　Ｉｌｅ　５．４２　２７５　７３，１５８，２１８　Ｐｒｏ　６．５８　２５９　５７．７３．１４２　Ｐｈｅ　７．３５　２３７　７３，１４４，２１８　ａ　ｃａｌｃｕｌ　ｄ　Ｖａｔｕｅ：ｒｅｆｅｒｒｉｎｇ　ｔ。ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉＶｅ　ｍｏｌｅｃｕ１ａｒ　ｍａｓｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｅｒｉＶａ一　ｔｉｖｅｓ．　图１经衍生化后的５种氨基酸选择离子色谱图　Ｆｉｇ　１　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｍｉｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ｉｆｖｅ　ｔａｒｇｅｔ　ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｉｎ　ＳＩＭ　１．２．４衍生化条件的优化：衍生化试剂的优化：本　６０　ｍｉｎ，每个温度下重复进样３次。　１．２．５氨基酸定量分析：６个不同浓度混标溶液　（０．５ｘ１０～ｇ／Ｌ、１×１０～ｇ／Ｌ、２ｘ１０～ｇ／Ｌ、５ｘ１０～ｇ／Ｌ、　７．５×１０　ｇ／Ｌ和１０￣１０　ｇ／Ｌ）进行ＧＣ　ＭＳ检测后计　算其峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，利　用外标法建立标准曲线，根据测定实际样本中各氨　基酸的峰面积进行浓度计算。　１．２．６精密度和添加回收率实验：用正常孕妇羊水　样本进行添加回收率和精密度实验，添加水平分别　为１×１０～ｇ／Ｌ、５×１０　ｇ／Ｌ和７．５×１０～ｇ／Ｌ，每个添　加水平平行测定５次，计算其回收率和日内、日间相　对标准偏差（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｄｅｖｉａｔｉｏｎ，ＲＳＤ）。　１．３统计学分析　实验数据用ＳＡＳ　９．２统计软件进行处理，计量　资料用均数±标准差（　±　）表示，应用两样本均数差　别的ｔ检验分析组间差异性。　２　结果　２．１衍生化试剂的优化结果　氨基酸具有极性功能团，不易挥发，所以进行　ＧＣ—ＭＳ分析前需要进行衍生化。硅烷化试剂是最　常用的衍生化试剂，挥发性强，热稳定性能好，操作　简单易行，可以获得较好的色谱图。对比ＢＳＴＦＡ和　ＭＳＴＦＡ两种衍生化试剂的效果，发现利用ＭＳＴＦＡ　衍生化时检测灵敏度更高，色谱图背景干扰较小，因　而选用ＭＳＴＦＡ作为本方法的衍生化试剂。　２．２衍生化时间的优化结果　当反应时间从４０　ｍｉｎ～６０　ｍｉｎ时，氨基酸平均　峰面积逐渐上升，６０　ｍｉｎ～８０　ｒａｉｎ时色谱峰面积趋　于稳定，因此衍生化反应时间选择为６０　ｒａｉｎ。衍生　结果如图２所示。　２．３衍生化温度的优化结果　实验发现，衍生温度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）在６０℃一　７０　时，每种氨基酸的平均峰面积随着温度的升高　
    一　一日　ｗ＆　任利红　ＧＣ—ＭＳ衍生化法检测先天性畸形羊水中的非极性氨基酸　印　∞　∞　∞　加　ｍ　４ｏ　５０　６０　７０　．．ｎｍｅ／Ⅱ１Ⅱ１　图２氨基酸衍生化时间优化图　Ｆｉｇ　２　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（ｉ蜘，ｎ＝３）　而增加；衍生温度在７０℃一８０℃时，平均峰面积逐　渐下降，因此，将７０℃确定为最优衍生温度。衍生　结果如图３所示。　图３氨基酸衍生化温度优化图　ｉＦｇ　３　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｉｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ（　，，ｌ＝３）　２．４氨基酸定量分析结果　被检氨基酸浓度在（０．５～１０）×１０　Ｌ范围内　线性关系良好，其线性方程（表３）的相关系数为　０．９９０　６—０．９９４　８。根据信噪比（ｓｉｇｎａｌ／ｎｏｉｓｅ，Ｓ／Ｎ＝　３）计算其最低检出限（１ｉｍｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ＬＯＤ）　范围为（０．１２～０．３８）×１０～ｇ／Ｌ。　２．５精密度和添加回收率　添加回收率在９１．１２％～１０４．４１％之间，ＲＳＤ在　０．８４％一９．３３％，充分说明该方法具有良好的回收率　和精密度，可满足临床检测的要求（表４）。　表３　５种氨基酸的线性范围、线性方程、最低　检出限及回归系数　Ｔａｂｌｅ　３　Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ　ｒａｎｇｅ，ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ，ｌｉｍｉｔａ－　ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ＣＯ－ｅｆｉｆｃｉｅｎｔ　（　）０ｆ　５　ａｎａｌｙｚｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　表４羊水中５种氨基酸的添加回收率和精密度结果　Ｔａｂｌｅ　４　Ｓｐｉｋｅｄ　ｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｅｃｉｓｉｏｎｓ　ｏｆａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ａｍｎｉｏｔｉｃ　ｆｌｕｉｄ　２．６先天性畸形儿孕妇和正常对照组羊水中的氨　基酸浓度比较　相比正常对照组，病例组的亮氨酸（Ｌｅｕ）和异　亮氨酸（Ｉｌｅ）显著下降（Ｐ＜Ｏ．０５）（表５）。　３讨论　先天性畸形是造成围产儿死亡的重要原因，种　类繁多，相关危险因素复杂　，且仍有许多种类的　疾病病因不明。深入研究探讨该病的发病机制对其　
    １００８　基础医学与临床　Ｂａｓｉｃ＆Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　表５两组孕妇羊水中的氨基酸浓度　Ｔａｂｌｅ　５　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｍｏｎｇ　ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ　ｍａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃ０ｎｔｒ０ｌ（　，１０一。ｇ／Ｌ，ｎ＝３）　预防及治疗有重要意义。有关该病的许多研究证　实，畸形形成过程中存在着多种氨基酸代谢紊　乱　Ｊ。本研究建立了气相色谱串联质谱法（ＧＣ．　ＭＳ）检测分析孕有先天性畸形儿的孕妇羊水中５种　非极性氨基酸含量的方法，旨在探讨氨基酸水平的　改变，并为该病的病因学研究提供理论基础，为其诊　治及预防提供理论依据。　目前，氨基酸的检测方法有酶法　ｊ、气相色谱法　（ＧＣ）　Ｊ、高效液相色谱质谱联用法（ＨＰＬＣ．Ｍｓ）　和　生物传感器法¨　等。酶法检测氨基酸时灵敏度低，　不能同时对多种氨基酸进行检测。ＨＰＬＣ．ＭＳ法对仪　器设备要求较高，不能被广泛推广。利用生物传感　器检测氨基酸需要固定化处理，且酶蛋白的选择有　一定的局限性＿１　。相对于其他分离技术，ＧＣ—ＭＳ技　术具有灵敏度高，抗干扰能力强，重复性好等优点，　对氨基酸的检测有一定的优势。　本次实验结果显示，疾病组和正常对照组相比，　疾病组的亮氨酸（Ｌｅｕ）与异亮氨酸（Ｉｌｅ）水平相比正　常组显著下降；而丙氨酸（Ａｌａ）、苯丙氨酸（Ｐｈｅ）和　参考文献：　［１］刘兴国．新生儿先天性畸形［Ｊ］．实用妇产科杂志，１９９４，　２９０—２９１．　［２］Ｐａｒｋ　ＹＹ，Ｓｏｈｎ　ＢＨ，Ｊｏｈｎｓｏｎ　ＲＬ，ｅｔ　ａ１．Ｙｅｓ—ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏ．　ｔｅｉｎ　１　ａｎｄ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｗｉｔｈ　ＰＤＺ—ｂｉｎｄｉｎｇ　ｍｏｔｉｆ　ａｃｔｉｖａｔｅ　ｔｈｅ　ｍａｍｍａｌｉａｎ　ｔａｒｇｅｔ　ｏｆ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｃｏｍｐｌｅｘ　１　ｐａｔｈ—　ｗａｙ　ｂｙ　ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　ｉｎ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２０１６，６３：１５９—１７２．　［３］Ｘｉｎｇ　Ｙ，Ｌｉ　Ｘ，Ｇｕｏ　Ｘ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　１　８　Ｄ—ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｒａｔ　ｐｌａｓｍａ　ｂｙ　ａｎ　ｕｌｔｒａｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ—ｔａｎｄｅｍ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｍｅｔｈｏｄ：　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ａｌｚｈｅｉｍｅｆｓ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｄ—ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｌｅｖｅｌ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ　Ｊ＿．　脯氨酸（Ｐｒｏ）虽有下降但无统计学意义。亮氨酸　（Ｌｅｕ）与异亮氨酸（Ｉｌｅ）均为人体必需氨基酸，属于　支链氨基酸。亮氨酸（Ｌｅｕ）可以通过刺激ＴＯＲ信号　通路，对Ｒｏｂｅｒｔｓ综合征有治疗作用　；而且２１一三　体综合征者也被发现有亮氨酸的减少　。说明亮　氨酸（Ｌｅｕ）代谢可能与先天性畸形的发生有关，值　得进一步深入研究。异亮氨酸（Ｉｌｅ）与亮氨酸（Ｌｅｕ）　理化性质相似，其在先天性畸形形成过程中的作用　有待于进一步研究。　本研究建立的ＧＣ．ＭＳ方法同时检测羊水中的　５种非极性氨基酸，成功应用到实际样本的检测，不　仅测定了每种氨基酸含量的变化，而且探讨了可能　的发病机制。该方法具有良好的灵敏度、精密度、准　确度以及回收率，符合生物样本中氨基酸的检测要　求，能够为该种疾病的诊治提供参考依据，具有良好　的应用前景。由于该病种类繁多且发病率不甚高，　临床收集病例样本过程困难，本实验样本量还很小，　且难以将其分门别类单独研究。后续期望大样本量　的相关实验进一步展开，论证本实验的结论。　Ａｎａｌ　Ｂｉｏａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，２０１６，４０８：１４１．１５０．　［４］李彬，王宏宇．７９例先天性畸形儿的相关因素分析［Ｊ］．　中国优生与遗传杂志，２０１６，２４：１０４—１０５．　［５］Ｋａｌｅ　Ａ，Ｋａｌｅ　Ｅ．Ｔｈｅ　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｉｎ　ｓｐｉｎａ　ｂｉｉｆｄａ　［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｏｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ，２０１２，３９：３７４—３７５：’　［６］Ｘｕ　Ｂ，Ｓｏｗａ　Ｎ，Ｃａｒｄｅｎａｓ　ＭＥ，ｅｔ　ａ１．Ｌ—ｌｅｕｃｉｎｅ　ｐａｒｔｉａｌｌｙ　ｒｅｓ—　ｃｕｅｓ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｚｅｂｒａｉｆｓｈ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｅｌｉａ　ｄｅ　Ｌａｎｇｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ，２０１５，２４：１５４０．１５５５．　［７］Ｋａｔｏ　Ｓ，Ｋｉｔｏ　Ｙ，Ｈｅｍｍｉ　Ｈ，ｅｔ　ａ１．Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａ．　ｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄ—ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｆ　Ｄ—ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｗｉｔｈ　ｈｉｇｈ—ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　
    任利红ＧＣ—ＭＳ衍生化法检测先天性畸形羊水中的非极性氨基酸　ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ　ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ—　［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ｂ　Ａｎａｌｙｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｍｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，　２０１１，８７９：３１９０—３１９５．　ｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｓｅｎｓ　Ｂｉｏｅ｜ｅｃｔｒｏｎ，２０１５，　６８：１６３．１６７．　［８］Ｋａｙａｃｅｌｅｂｉ　ＡＡ，Ｋｎ￣ｉｆｅｌ　ＡＫ，Ｂｅｃｋｍａｎｎ　Ｂ，ｅｔ　ａ１．Ｍｅａｓｕｒｅ．　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｕｎｌａｂｅｌｅｄ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ　ｉｓｏｔｏｐｅ－ｌａｂｅｌｅｄ　ｈｏｍｏａｒｇｉｎｉｎｅ，　［１１］李辉欣，鞠建松，张琳琳，等．Ｄ一氨基酸检测方法研究进　展［Ｊ］．生物技术通报，２０１３，２４６：６８．７２．　ａｒｇｉｎｉｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ　ｉｎ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓａｍｐｌｅｓ　ｂｙ　ＧＣ—　ＭＳ　ａｎｄ　ＧＣ－ＭＳ／ＭＳ［Ｊ］．Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ，２０１５，４７：　２０２３—２０３４．　［１２］Ｘｕ　Ｂ，Ｓｏｗａ　Ｎ，Ｃａｒｄｅｎａｓ　ＭＥ，ｅｔ　ａ１．Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ　ｐａｒｔｉｌａｌｙ　ｒｅｓｃｕｅｓ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ　ａｎｄ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　ｄｅｆｅｃｔｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　［９］Ｋｏｇａ　Ｒ，Ｍｉｙｏｓｈｉ　Ｙ，Ｓａｔｏ　Ｙ，ｅｔ　ａ１．Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｒ—　ｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｔｒｕｌｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｕｒｉｎｅ　ｏｆ　ｄ．ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｏｘｉｄａｓｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ　ｍｉｃｅ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｔｗｏ－・ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ　ｈｉｇｈ－－　ｗｉｔｈ　ｚｅｂｒａｆｉｓｈ　ｍｏｄｅｌｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｎｅｌｉａ　ｄｅ　Ｌａｎｇｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．　Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ，２０１５，２４：１５４０—１５５５．　［１３］Ｃｏｐｐｕｓ　ＡＷ，Ｆｅｋｋｅｓ　Ｄ，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ　ＭＡ，ｅｔ　ａ１．Ｐｌａｓｍａ　ａ—　ｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｎｄ　ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ　ｉｎ　ｈｅａｌｔｈｙ　ｐｅｒｓｏｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｄｏｗｎ’Ｓ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　ｌｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｊ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ　Ａ，２０１６，１４６７：３１２—３１７．　ｓｙｎｄｒｏｍｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｎｅｕｒｌａ　Ｔｒａｎｓｍ（Ｖｉｅｎｎａ），２００７，１１４：　】Ｏ４】一】Ｏ４　５＿　［１０］Ｍａｒｔｉｎ　Ａ，Ｂａｔａｌｌａ　Ｐ，Ｈｅｒｎ６ｎｄｅｚ—Ｆｅｒｒｅｒ　Ｊ，ｅｔ　ａ１．Ｇｒａｐｈｅｎｅ　ｏｘｉｄｅ　ｎａｎｏｒｉｂｂｏｎｏｂａｓｅｄ　ｓｅｎｓｏｒｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｓｉｍＵｈａｎｅｏｌ】ｓ　ｂｉ０．　新闻点击　生育与低死亡风险相关　据美国国家科学院院报（ＰＮＡＳ）网站（２０１５—１１－１０）报道，最近一份研究指出，生育因素与降低女性全因死亡风险（ａ１１．　ｃａｕｓｅ　ｄｅａｔｈ）、癌症及心Ｊ往／血管疾病的死亡风险有关。　研究团队利用欧洲癌症与营养的前瞻性调查（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｉｎｔｏ　Ｃａｎｃｅｒ　ａｎｄ　Ｎｕｔｉｒｔｉｏｎ），找到并分析来　自１０个国家共３２２　９７２名女性的资料，其中包括饮食习惯、生活模式、个性与医疗纪录；在历时１２．９年的追踪后，有５　９３８名　女性死于癌症、２　４０４名死于循环系统相关疾病。　研究发现，整体来说，生育年龄在２６—３０岁之间的女性的死亡风险较生育年龄小于２０及大于３１岁的女性低；曾经母乳　哺育的女性的风险较未曾母乳哺育者低；初经年龄在１５岁以上的风险较１２岁以下者低；未曾吸烟或曾经吸烟的女性中，服用　避孕药者的风险较低。针对癌症死亡风险，曾经生育过或生过２～３胎者的风险较未生育者、仅生一胎者低；未曾吸烟或曾经　吸烟的女性中，服用避孕药的女性的风险也较低。最后，针对心且壹／血管疾病死亡风险，曾经生育过、母乳哺育或初经年龄在　１５岁以上者的风险较低。研究还发现生育再加上母乳哺育的经验可以降低缺血性心脏病（ｉｓｃｈｅｍｉｃ　ｈｅａｒｔ　ｄｉｓｅａｓｅ）的死亡　风险。　该研究刊登于最新一期ＢＭＣ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ。　产后糖尿病可以预知　据美国国家科学院院报（ＰＮＡＳ）网站（２０１５－１０—２８）报道，妊娠糖尿病指的是仅在女性怀孕期间发生的糖尿病，约有２—７％　的孕产妇会患病。虽然原则上此病症在生产结束后便会消失，但是曾经患妊娠糖尿病的女性在往后的日子里发展出产后糖　尿病的风险却会增加。为了更有效的控制与预防女性产后糖尿病的发生，德国赫蒙霍兹慕尼黑卫生与环境研究中心　（Ｈｅｌｍｈｏｈｚ　Ｚｅｎｔｒｕｍ　Ｍｆｉｎｃｈｅｎ）近日研发出预测妊娠糖尿病患者产后糖尿病发展概率的方法。　研究人员搜集了２５７位在１９８９～１９９９年间曾患妊娠糖尿病女性的数据进行分析，其中包含这些女性生产后长达２０年的　追踪数据。研究发现其中有１１０位女性在追踪期间发展出产后糖尿病。为了能够了解发展出产后糖尿病患者的特质，研究主　持人Ａｎｅ￣ｅ—Ｇａｂｒｉｅｌｅ　Ｚｉｅｇｌｅｒ加入了数个学界熟知与此病症相关的变项进行分析。　研究者Ｍｅｉｋｅ　Ｋｏｈｌｅｒ认为，根据分析结果，要计算个人发展出产后糖尿病的风险其实并不难。身体质量指数（ＢＭＩ值）、个　体的基因倾向、哺喂母乳的状况与妊娠期的糖尿病是否有使用胰岛素治疗等都是重要的影响因素。　而根据研究者所设计的这套以记点方式评估产后糖尿病发展风险的系统，得分落在低风险区间的女性在产后５年内发展　出糖尿病的概率为１１％；中度风险区间为２９—６４％；分数为高风险者的概率则为８０％以上。　该研究刊登于最新一期Ａｃｔａ　Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉｃａ。　

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