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正在进行安全检测...

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实验名称
TotalRNAextractandcDNA合成
1、细胞培养在细胞房.，25℃(室温。
总RNA提取和cDNA的合成在实验室2操净台里操作，25℃(室温。实验环境2、3、Real-timePCR在精密仪器室里进行，25℃(室温。
1、细胞培养基hyclone（加双抗和10％的血清）2、胰酶Gibcocat：
25200-072实验材料3、RNAsimpleTotalRNAKit总RNA提取试剂盒（离心柱型）DP419
（天根公司）
4、氯仿、无水乙醇、灭酶枪头
5、FastQuantcDNA第一链合成试剂盒KR106（天根）实验仪器StepOnePlusPCR扩增仪，ABIPCR仪
TotalRNAextract：
1、6cmDish细胞长满后，吸去培养基，加入1mlRZ，用枪头吹打至溶液透明，放置3min；
2、加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置3min；3、4℃12,000rpm离心10min；（此时可制备琼脂糖凝胶）
4、吸取上清液（400~500ul）于新的离心管，缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）；
5、将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中，4℃12,000rpm离心30sec，若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，可分两次转入吸附柱CR3并离心，弃掉收集管中的废液；6、向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD，4℃12,000rpm离心30sec，弃废液，将CR3放入收集管中；7、向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW，室温静置2min，4℃12,000rpm离心30sec，弃废液；
实验操作8、重复步骤7；
9、将吸附柱放入2ml收集管中，4℃12,000rpm空离30sec，去除残余液体。将吸附柱CR3于超净工作台上通风片刻，以充分晾干；10、将吸附柱CR3转入一个新的1.5ml离心管中，加30-100μlRNase-FreeddH2O，室温放置2min；11、4℃12,000rpm离心2min；
12、琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性并测定浓度
13、以提取的RNA作为模板合成cDNA或将RNA存于-80℃备用。
cDNA合成：（20μl体系）50ng-2μg总RNA1、将模板RNA在冰上解冻；5×gDNABuffer、FQ-RTPrimerMix、10×FastRTBuffer、RNase-FreeddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。（为保证准确性，先配成Mix，再分装到每个反应管中）

2、按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。
表1gDNA去除反应体系组成成分5×gDNABufferTotalRNARNase-FreeddH2O使用量2μl
一般8μl补足到10μl3、按照表2的反转录反应体系配制混合液。
表2反转录反应体系
组成成分
10×FastRTBufferRTEnzymeMixFQ-RTPrimerMixRNase-FreeddH2O匀。
5.42℃，孵育15min，95℃，孵育3min之后放于冰上，得到的cDNA可用于后续实验，或-20℃保存

使用量2μl1μl2μl补足到10μl4.将反转录反应中的Mix，加到gDNA去除步骤的反应液中，充分混

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