实验八丙酮酸含量的测定

一、目的

丙酮酸是一种重要的中间代谢物。通过本实验掌握测定植物组织中丙酮酸含量的原理和方法，增加对代谢的感性认识。

二、原理

植物样品组织液用三氯乙酸除去蛋白质后，其中所含的丙酮酸可与 2,4- 二硝基苯阱反应，生成丙酮酸一 2 ， 4 一二硝基苯踪，后者在碱性溶液中呈樱红色，其颜色深度可用分光光度计测量。与同样处理的丙酮酸标准曲线进行比较，即可求得样品中丙酮酸的含量。

三、仪器、试剂和材料

1 .仪器

（ 1 ）分光光度计

（ 2 ）离心机（ 4000r/min)

（ 3 ）容量瓶（ 25 ml ）

（ 4 ）研钵

（ 5 ）具塞刻度试管（ 15 ml )

（ 6 ）刻度吸管（ 1ml ， 5 ml )

（ 7 ）电子顶载天平

2 .试剂

（ 1 ） 1.5 mol/L NaOH

（ 2 ） 8% 三氯乙酸（当日配制置冰箱中备用）

（ 3 ） 0.1% 2,4 一二硝基苯肼：称取 2 ， 4 一二硝基苯肼 100mg, 溶于 2mol/L HCl 中使成 100ml ，盛入棕色试剂瓶，保存于冰箱内。

（ 4 ）丙酮酸标准液（ 60ug/ml ）：精确称取 7 . smg 丙酮酸钠，用 8 ％三氯乙酸溶解并定容至 l00ml 保存于冰箱内。

3 .材料

大葱、洋葱或大蒜的鳞茎。

四、操作步骤

1 .丙酮酸标准曲线的制作

取 6 支试管，按下表加入试剂：

在上述各管中分别加入 1.0ml 0.1 ％的 2 ， 4 —二硝基苯肼液，摇匀，再加入 5ml1.5mol/LNaOH 溶液，摇匀显色，在 520nm 波长下比色。作标准曲线。

2 .植物材料提取液的制备

称取 1g 植物材料（大葱、洋葱或大蒜）于研钵内加适量 8% 三氯乙酸，仔细研成匀浆，再用 8% 三氯乙酸洗入 25ml 容量瓶，定容至刻度。塞紧瓶塞，振摇提取，静置 30min 。取约 10ml 匀浆液离心（ 4000 r/min ） 10min ，上清液备用。

3 .组织液中丙酮酸的测定

取 1. 0ml 上清液于一刻度试管中，加 2ml 8 ％三氯乙酸，加 1.0ml 0 . 1 ％ 2 ， 4 －二硝基苯肼液，摇匀，再加 5 . Oml 1 . 5mol/1, NaOH 溶液，摇匀显色，在 520 nm 波长下比色，记录吸光度，在标准曲线上查得测定管（ 7 号）的丙酮酸含量。

五、结果处理

式中， A 为在标准曲线上查得的丙酮酸的微克数。

六、注意事项

1. 所加试剂的顺序不可颠倒，先加丙酮酸标准液或待测液，再加 8% 三氯乙酸，最后加 1.5mol/ L NaOH 。

2 .应反应 10min 后再比色。

3 .标准曲线的各点应分布均匀，范围适中。

七、思考题

测定丙酮酸含量的基本原理是什么？