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安全验证
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1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。
【实验原理】
质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。
在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competentcell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1x108转化子/μgDNA，甚至1x109转化子/μgDNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。
微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。
【试剂与器材】
〈一〉试剂
1．LB液体培养基:参见附录
每组配200mL,其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。
2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1） : 配1LLB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右,加氨苄青霉素(Ampicillin至终浓度100μg/ml(Amp储存液一般为100mg/mL,倒平板，每皿倒约15mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL50mg/mLX-gal和100μLLIPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。
每组制备LB平板2个，LB/Amp平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。
3．IPTG储存液L：IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。
4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。
5．1mol/LCaCl2储存液，使用浓度为L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。
6．甘油(灭菌，全班50mL，同上高压灭菌。
7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。
〈二〉器材
1.37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等
2.高速冷冻离心机
3.微量移液器等
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