当前位置：首页> 安全验证

安全验证

时间：下载该word文档

粪便新型冠状病毒抗原检测试剂盒的研制
摘要目的：建立粪便新型冠状病毒（2019novelcoronavirus，2019-nCoV）抗原胶体金检测试剂的制备方法，并对试剂的性能指标进行初步评价。方法：采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，用新型冠状病毒N蛋白抗体作为标记抗体，硝酸纤维素膜上包被另一新型冠状病毒抗体，并用羊抗兔多克隆抗体和兔IgG作为独立质控线系统制备胶体金检测试剂；对试剂的加速稳定性、特异性及临床诊断性能进行评价。结果：试剂盒37℃加速破坏3周稳定。试剂盒与隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性样本无交叉反应。确诊及健康人群样本测试，灵敏度为28.00%(14/50，特异性为100.00%(120/120，Kappa值为0.3544（P<0.05）。结论：粪便新型冠状病毒抗原检测试剂盒（胶体金法）灵敏度不足，不宜用于筛查，若将本检测试剂作为病人出院检测的补充，与呼吸道样本核酸检测一起，可降低潜在的粪口传播风险，为疫情防控增加一道防线。
关键词新型冠状病毒抗原胶体金
新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60~140nm。病毒对紫外线和热敏感，56℃30分钟、乙醚、75%乙醇、含氯消毒剂、过氧乙酸和氯仿等脂溶剂均可有效灭活病毒。经呼吸道飞沫和密切接触是新型冠状病毒的主要传播途径。在粪便及尿液中可分离到新型冠状病毒。我国新型冠状病毒肺炎的诊断依照中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（以下简称“诊疗方案”）进行，其中用于辅助诊断的检测方法主要为使用实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸及进行病毒基因测序，诊疗方案试行第7版中增加了通过检测血清中新型冠状病毒特异性IgM和IgG抗体作为新型冠状病毒肺炎确诊依据。
胶体金免疫层析技术已广泛应用于病原体抗原及特异性抗体的检测，如轮状病毒抗原、丙型肝炎病毒抗体检测等，均有成熟产品上市。目前已通过国家药品监督管理局注册审批的新型冠状病毒检测试剂主要有基于荧光PCR法的核酸检测试剂盒、基于胶体金法和化学发光法的新型冠状病毒IgM/IgG抗体检测试剂盒。基于胶体金法的试剂，以其反应快速、不需特殊仪器、试剂保存条件简单，在疫情防控中起了重要作用。
本研究采用胶体金免疫层析技术，研制检测粪便中新型冠状病毒N蛋白的试剂盒，并对试剂盒的性能进行初步评价，评估试剂盒在临床应用中的价值。1材料与方法1.1材料与试剂
1.1.1样本来源确诊病例粪便样本50例；本实验室2019年收集保存的健康人群粪便样本120例，隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性粪便样本各5例。
1.1.2主要试剂氯金酸、牛血清白蛋白购自Sigma公司；硝酸纤维素膜购自Pall公司；新型冠状病毒抗体对、新型冠状病毒N蛋白购自菲鹏生物股份有限公司；高浓度、低浓度和阴性质控品为本司制备；其他试剂为国产分析纯。1.2方法
1.2.1胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液。向1000mL超纯水中加入40mL1%氯金酸溶液，混匀后于加热磁力搅拌器上加热至沸腾，快速一次性加入30mL2%的柠檬酸三钠溶液，当溶液颜色从黑色变为稳定的亮红色后继
续煮沸2~3min，关闭加热器，冷却后以超纯水恢复至原体积。用紫外分光光度计对胶体金溶液进行测定，记录波峰λ、波宽Δλ（λB-λA）见图1。

1.2.2抗体标记条件的选择
1.2.2.1最佳标记pH的确定通过加入不同体积的0.2M碳酸钾溶液将胶体金溶液调节至不同pH，向pH值不同的胶体金溶液中加入终浓度为50μg/mL的待标记蛋白，混匀，室温静置20分钟，再加入10%氯化钠溶液，混匀，室温静置1小时，观察各胶体金溶液颜色变化，记录颜色保持不变的溶液所加入的0.2M碳酸钾溶液的体积。
1.2.2.2最小标记蛋白浓度的确定按已确定的最佳标记pH值，向胶体金溶液中加入适量0.2M碳酸钾溶液，混匀后加入不同终浓度的待标记蛋白，混匀，室温静置20分钟，再加入10%氯化钠溶液，混匀，室温静置1小时，观察各胶体金溶液颜色变化，记录颜色保持不变的溶液所加入的待标记蛋白的浓度。1.2.3金标垫的制备
1.2.3.1胶体金标记物的制备取胶体金溶液至干净的烧杯中，按照优化的标记pH条件，加入0.2M碳酸钾调整pH，搅拌均匀，加入适量待标记的新型冠状病毒抗体（标记量20μg/mL）、质控线标记抗体（标记量10μg/mL），搅拌均匀，再加入适量10%BSA溶液，继续搅拌均匀；搅拌结束后，离心收集沉淀，用金标垫稀释液复溶至原胶体金体积的1/10，2~8℃避光保存备用。
将胶体金标记物用金标垫稀释液稀释，以46mL/张的液量浸泡玻璃纤维处理成金标垫，将浸泡完成的金标垫进行冻干，冻干后的金标垫在湿度不高于25%的环境下，放入装有硅胶干燥剂的铝箔袋密封，2~30℃保存备用。
1.2.4稳定性研究将制备好的试剂卡置于37℃环境下，每隔1周用高浓度、低浓度和阴性质控品进行测试，每个样本重复3次，比较第1周、第2周、第3周、第4周加速破坏试剂与对照试剂（0周）检测结果的差异。
1.2.5特异性试验检测粪便隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性粪便样本，考察常见的肠道出血及胃肠道病原体对本试剂检测结果的影响。
1.2.6临床性能评价检测确诊病例50例及健康人群120例，统计灵敏度、特异性、总符合率及95%置信区间，分析kappa值，评价本试剂检测结果与临床诊断的一致性。2结果
2.1胶体金溶液测定
使用紫外分光光度计对胶体金溶液进行测定，结果如图2所示，波峰λ约为525nm，波宽Δλ约为90nm。波峰λ在520~530nm范围内，波宽Δλ在≤130nm范围内，表明所制备的胶体金粒径均一，尺寸分布较窄，符合使用需求。
2.2抗体标记条件的选择2.2.1最佳标记pH的确定
不同pH的胶体金溶液颜色变化情况见表1。表1不同pH的胶体金溶液颜色变化情况
选择0.2M碳酸钾溶液加入量为12.5μL/mL胶体金作为检测线标记蛋白的标记pH。

2.2.2最小标记蛋白浓度的确定
不同蛋白加入量的胶体金溶液颜色变化情况见表2。表2不同蛋白加入量的胶体金溶液颜色变化情况
选择标记蛋白终浓度为20μg/mL胶体金作为检测线标记蛋白的标记浓度。2.2.3加速稳定性
37℃加速稳定性结果见表3。
结果表明，37℃加速破坏3周，检测线强度与对照相当；第4周时，低浓度质控品的检测线有所变浅。参照《中国生物制品规程》（2000版）对胶体金产品的规定，37℃至少20天的加速稳定性试验，可用于评估有效期18个月的产品性能。据此推测，本试剂盒的效期可达18个月。2.2.4特异性
结果表明，粪便隐血阳性、轮状病毒阳性、腺病毒阳性、诺如病毒阳性、幽门螺杆菌阳性的样本，均未检出阳性结果。由于样本为疫情爆发前收集保存，故预期结果均为阴性，实测结果与预期结果一致，常见的肠道出血及胃肠道病原体的存在不会造成检测结果假阳性。2.2.5临床评价
50例检测确诊病例粪便样本及120例健康人群样本临床统计结果见表5。与临床结果比较，本试剂盒检测灵敏度为28.00%（95%CI：16.23%-42.49%），特异性为100.00%（95%CI：96.97%-100.00%），总符合率为78.82%（95%CI：71.91%-84.71%），Kappa值为0.3544