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    一株猪源屎肠球菌的分离、鉴定及益生功能初步研究
    王凡;王建设;刘婷;李晓清;王安如
    【摘要】Inthisarticle,strainZW002belongedtoLactobacilluswasisolatedfromhealthypigfeces.Accordingtotheresultsofmorphological,physiological,biochemicaltests,andsequenceanalysisof16SrRNAgene,strainZW002wasidentifiedasEnterococcusfaecium,theaccessionnumberof16SrRNAgeneisJN542513.Moreover,thepreliminarystudyofitsbeneficialeffects,likeacidresistance,bilesalttoleranceandantibacterialactivitywascarriedout.TheresultsshowedthatstrainZW002exhibitedgoodstresstoleranceandantibacterialactivity,whichleadstrainZW002tobeapromisingcandidateforprobioticresearch.%从健康仔猪粪便中分离到一株乳酸菌ZW002,并从形态、生理生化指标,16SrRNA基因序列分析,鉴定该菌株为屎肠球菌(Enterococcusfaecium,将其16SrRNA基因提交GenBank,登录号为JN542513.从耐酸、耐胆盐及抑菌性能等方面对菌株进行益生功能初步研究,结果表明,菌株ZW002表现出良好的耐受性及益菌性能,为猪用微生态制剂的研究开发奠定了基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷,期】2012(039007【总页数】4页(P231-234
    【关键词】益生菌;屎肠球菌;鉴定;益生性能【作者】王凡;王建设;刘婷;李晓清;王安如

    【作者单位】北京大北农科技集团股份有限公司,饲用微生物工程国家重点实验室,北京100193;北京大北农科技集团股份有限公司,饲用微生物工程国家重点实验室,北京100193;北京大北农科技集团股份有限公司,饲用微生物工程国家重点实验室,北京100193;北京大北农科技集团股份有限公司,饲用微生物工程国家重点实验室,北京100193;北京大北农科技集团股份有限公司,饲用微生物工程国家重点实验室,北京100193【正文语种】中文【中图分类】Q78

    益生素（probiotics）是一类能通过调控生物体微生态平衡进而有效促进宿主健康和生长的活微生物制剂，又被称为活菌制剂、微生态制剂等（Golden，1998，Fioramonti等，2003）。微生态制剂具有绿色安全、无毒、无残留等优点，并且在增强禽畜免疫力，提高生长性能、降低死亡率等方面具有良好功效，已经在作为饲料添加剂得到广泛应用，以减少抗生素类添加剂使用量。使用最早、最广泛的微生态制剂是乳酸菌制剂，其次是芽孢杆菌制剂和真菌及酵母类制剂。屎肠球菌属于乳酸菌，在很多新出生2～3d的动物内占优势地位（Devriese等，1991），具有生长速度快，对肠道具有较好黏附力，易于培养与保存，能产有机酸、细菌素等抗菌物质（Maia等，2001）的特点，因而相对于双歧杆菌等严格厌氧型乳酸菌更便于商业化应用。1989年美国FDA就公布它为可直接用于动物的菌种之一，国内的许多微生态产品中都添加有屎肠球菌，显示出其在畜牧生产工业中广泛的应用发展前景。本研究从健康仔猪粪便中，分离得到一株乳酸菌ZW002。利用常规形态、生理生化试验及分子生物学试验相结合的多相分类技术（Colwell，1970；Rainey等，1995），最终鉴定为屎肠球菌（Enterococcusfaecium）。同时，
    对菌株ZW002进行益生功能初步测定，以期得到性能优良的屎肠球菌新菌株应用于商业化产品。1材料与方法
    1.1主要试剂及培养基普通细菌基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；Taq酶、dNTP等购于北京康为世纪生物科技有限公司；PCR反应引物由上海英骏生物技术有限公司合成；常规化学试剂购于北京奥博星生物技术有限公司；产肠毒素性大肠杆菌K88和K99菌，由饲用微生物工程国家重点实验室保存。MRS液体培养基：蛋白胨10g，牛肉浸膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖5g，K2HPO42g，柠檬酸氢二铵2g，乙酸钠5g，Tween－801mL，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，加蒸馏水定容至1000mL，调pH为7.0，121℃灭菌20min。MRS固体培养基：在MRS液体培养基的基础上加入1.5%的琼脂。筛选培养基：MRS固体培养基中添加0.75%CaCO3。
    1.2菌株的分离与纯化无菌采集动物粪便1g，用无菌生理盐水梯度稀释后取0.1mL涂布于含有0.75%CaCO3的MRS固体培养基上，37℃厌氧培养。48h后挑取钙圈明显，表面光滑凸起，周边整齐，直径1.0～1.5mm的菌落，划线接种于MRS培养基上，涂片，革兰氏染色镜检，筛选革兰氏阳性菌株。将筛选菌株在MRS平板上划线接种，获得纯培养。1.316SrRNA基因序列分析
    1.3.1基因组DNA的提取用普通细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株的基因组DNA。
    1.3.216SrRNA基因的PCR扩增采用Monis（2005）介绍的细菌通用引物27F和1492RPCR扩增其16SrRNA基因片段。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30次循环；72℃延伸5min，4℃恒温保存。将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，片段约
    1500bp的阳性产物直接送上海英骏生物技术有限公司测序。
    1.3.3系统发育树的构建根据16SrRNA测序结果，与GenBank中的序列进行BLAST，选取与菌株ZW002相似率最高菌株的16SrRNA基因序列，利用Mega4.0软件中的邻位连接法构建系统发育树（Saitou，1987），进一步分析菌株分类学地位。
    1.4屎肠球菌的形态和生理生化指标鉴定根据《常见细菌系统鉴定手册》中屎肠球菌的生理生化特征，对菌株进行细胞形态、产酶特征、温度、NaCl耐受性、pH耐受性及糖代谢等指标的测定。1.5屎肠球菌的耐受性
    1.5.1屎肠球菌对低pH的耐受性将供试菌株按1%接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养过夜（16h），8000r/min离心2min，并分别用pH2.0、3.0和4.0的MRS培养液重悬，以原菌液作为对照，分别在3h取菌液涂布，记录活菌数。
    1.5.2屎肠球菌对胆盐的耐受性将供试菌株按1%接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养过夜（16h），8000r/min离心2min，并分别用含有0.1%、0.2%、0.3%猪胆盐的MRS培养基重悬，以原菌液作为对照，分别在2h取菌液涂布，记录活菌数。
    1.5.3菌株存活率计算菌株的存活率的计算公式为：

    其中，N1—菌株处理后活菌数；N0—菌株初始活菌数（高鹏飞等，2009）。1.5.4屎肠球菌抑菌能力的测定采用牛津杯法测定屎肠球菌对大肠杆菌K88和大肠杆菌K99的抑制能力（刘冬梅等，2006）。2结果与分析
    2.1菌落形态及特征在MRS平板上37℃培养24h，菌落呈灰白色、不透明、表
    面光滑、直径0.5～1mm大小的圆形。菌体为球杆状，革兰氏阳性，无芽孢，无鞭毛。
    2.216SrRNA基因序列分析16SrRNA基因是细菌系统分类学研究中最常用于分析的基因，它存在于所有的原核生物中，含量大，分子大小适中（约1.5kb），其基因序列中既含保守序列又含可变序列，便于进行进化距离的分析研究。获得菌株16SrRNA基因序列后，提交至Gen－Bank，登录号为JN542513。利用Mega4.0软件构建系统发育树（图1），选取Tetragenococcushalophilus作为外群。结果显示，菌株ZW002与屎肠球菌（E.faecium）（Schleifer等，1984）、E.durans（Collins，1984）、E.hirae（Farrow，1985）亲缘关系最近，16SrRNA基因相似性分别为99.8%、99.2%、99.1%。
    图1根据16SrRNA基因序列构建Enterococcussp.ZW002与该属部分模式种的系统发育树
    2.3生理生化特征菌株的生理生化特征见表1，菌株ZW002生理生化特征与屎肠球菌一致。结合16SrRNA基因分析结果、菌株的显微特征及在MRS培养基上的菌落特征，可确定，菌株ZW002为屎肠球菌。
    2.4耐受性试验结果胃是消除病原微生物进入体内的第一道屏障，但同时酸性环境会对益生菌的活力产生不利的影响。动物消化道正常pH范围2～8，胃液pH通常为3.0，食物在胃里的时间一般为1～2h，因此选择3个不同pH（2.0、3.0、4.0），培养时间为3h，计算菌株对酸的耐受性。试验结果显示，经过37℃温育3h之后，在pH2.0、3.0、4.0的存活率分别为79%、81%、95%。胆盐是干细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的钠盐或钾盐，是胆汁参与消化和吸收的主要成分。胆盐的耐变性试验结果显示，经过37℃温育2h之后，菌株在0.1%、0.2%和0.3%的猪胆盐中存活率分别为95%、90%、78%。这些说明，此菌株对胆盐有较好的耐受性。

    表1菌株ZW002的生理生化特征试验项目结果试验项目结果苦杏仁苷＋水杨苷＋L－阿拉伯糖＋山梨醇＋纤维二糖＋蔗糖－七叶灵＋接触酶反应＋果糖＋氧化酶反应＋半乳糖－生长温度10℃＋葡萄糖＋30℃＋葡萄糖酸钠－40℃＋乳糖＋45℃＋麦芽糖＋50℃－甘露醇＋生长NaCl3%＋甘露糖＋5%＋松三糖－7%＋蜜二糖＋9%－棉子糖－pH4.5＋鼠李糖－7.2＋核糖＋9.6－
    2.5抑菌能力测定结果致病型大肠杆菌K88、K99是常见的引起仔猪腹泻的主要致病菌，抑菌试验结果显示，菌株ZW002对这两种菌都有较强的抑制作用，抑菌圈直径分别为17、15mm，这为菌株ZW002作为益生菌制剂提供了有利条件。3讨论
    国外将屎肠球菌作为饲料添加剂已经有多年的研究历史，近年来，亦有学者利用屎肠球菌开发出保健食品用于降低人血清胆固醇（袁杰利等，2003），其安全性已经得到了认可。因此，在饲料微生态添加剂的研究中，分离筛选出优良性能的工业菌株显得尤为关键。但目前所用的益生菌大多为体外筛选而得，由于体内外环境差异极大，外源微生物必须经过定植、竞争和排斥才能在动物肠道中生存，因此微生态制剂的作用效果取决于菌株的来源。现在许多学者认为，理想的益生菌菌株来源最好为动物的肠道，同时，由于不同动物肠道的特异性菌群，菌株的来源应与使用对象一致，因此，从猪肠道获得的菌株制成的微生态制剂更易于在猪肠道定植并发挥作用。本研究选择健康猪粪便分离筛选出菌株屎肠球菌ZW002，经过初步筛选，表现出较好的抗逆性及益生性能，为微生态制剂的产品开发奠定了基础。但是，从菌株到商业化产品之间还有许多工作，如对筛选的菌株进一步进行抗逆性驯化、安全性评价、发酵培养条件与包埋材料及技术的选择，菌种的复配问题，动物饲养效果功效评价等都需要在后续的研究中展开。参考文献

    1刘冬梅，李理，杨晓泉，等.用牛津杯法测定益生菌的抑菌活力［J］.食品研究与开发，2006，27（3）：110～111.2侯成立，季海峰，周雨霞，等.益生菌的作用机制及其在母猪生产中的应用［J］.中国畜牧兽医，2011，38（7）：20～22.3袁杰利，傅晓丽，文姝，等.屎肠球菌活菌制剂的研究［J］.中国微生态学杂志，2003，15（1）：20～21.4高鹏飞，孙志宏，麻士卫，等.蒙古族儿童源益生特性双歧杆菌的筛选及鉴定［J］.微生物学报，2009，2：210～216.5CollinsMD，JonesD，FarrowJAE，etal.Enterococcusaviumnom.rev.，comb.nov.，E.casseliflavusnom.rev.，comb.nov.，E.duransnom.rev.，comb.nov.，E.gallinarumcomb.nov.，andE.malodoratussp.nov［J］.IntJSystBacteriol，1984，34：220～223.6ColwellRR.PolyphasictaxonomyofthegenusVibrio：numericaltaxonmyofVibriocholerae，Vibrioparahaemolyticus，andrelatedVibriospecies［J］.JBacteriol，1970，104：410～433.7DevrieseLA，HommezJ，WijfelsR，etal.compositionoftheenterococcalandstreptococcalintestinalfloraofpoultry［J］.JApplBacteriol，1991，71：46～50.8FarrowJAE，CollinsMD.Enterococcushirae，anewspeciesthatincludesaminoacidassaystrainNCDO1258andstrainscausinggrowthdepressioninyoungchickens［J］.IntJSystBacteriol，1985，35：73～75.9FioramontiJ，TheodorouV，BuenoL.Probiotics：whatarethey？Whataretheireffectsongutphysiology［J］.BestPractice＆ResearchClinicalGastroenterology，2003，17（5）：711～724.
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