DNA序列测定

DNA序列测定是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。可分离相差仅1个碱基的300～500bp的核酸分子。

常用测序方法：

1. 双脱氧末端终止法

1.1.1 测序原理

四个反应管中，在DNA聚合酶催化下，以单链DNA为模板，加入单引物、四种dNTP，以及每管中加入双脱氧核糖核苷酸ddA、ddT、ddG、ddC。双脱氧核苷酸(ddNTP)的5`端-OH是正常的，而其3`端-OH则没有，因此能与引物延伸链的3`端连接，而不能连接其后继核苷酸，于是引物链的延伸至此结束，经过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后，根据电泳图谱即可拼出所测DNA序列。

1.1.2 测序步骤

A 测序DNA模板制备

测序可分为单链测序与双链测序，对于未知序列可采用单链测序，而对于已知DNA序列可采用双链测序。但不管单链测序还是双链测序，其测序反应都一样。其中单链模板可通过将待测DNA片段克隆到噬菌体M13中或通过不对称PCR制备 ；双链模板可通过将待测DNA片段克隆到质粒DNA中或通过PCR扩增制备。所得模板DNA应通过纯化处理才能用于后继测序反应。

B 测序引物的设计

测序所用引物一般采用通用引物，也可根据已有序列设计引物，引物一般有15～30个碱基，应遵循一般引物设计原则

a、G+C含量为45～55%。

b、3端最好以A或C结尾，不要以T结尾。

c、引物长度以15～30bp为宜。

d、引物本身不能形成二级结构。

C 四种测序反应液的制备

测序反应液组成：反应缓冲液、DNA聚合酶、Mgcl2、引物、纯水、四种dNTP，分别在四个反应管中加入一种相应ddNTP。

标记物：测序反应的标记物有核素和荧光染料。标记载体有引物、dNTP、ddNTP。

现在应用较多的是将荧光染料标记于引物或ddNTP上，因核素对环境的污染而逐渐应用得比较少。但也可以不进行标记而采用银染系统检测。

D 延伸反应

引物在DNA聚合酶的催化下，按碱基互补原则逐步在引物的3’端加上四种脱氧核糖核苷酸，四个反应管中的ddNTP随机地与dNTP竟争结合位点，于是引物延伸链随机终止在各个可能位点，在电泳图谱上形成一系列相差一个核苷酸的单链DNA梯带。

E 电泳与读序

反应产物与甲酰胺混和，并高温加热变性后，于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

注：对于没有标记的测序反应，电泳完成后可用银染将DNA标记、拍照、读序。

对于用核素标记的测序反应，按核素操作规程拍照。

对于用荧光染料标记的测序反应，现有一些商业生物技术公司开发的测序仪可在电泳过程中进行检测。

1.1.3 末端终止法图示

原理示意图

电泳示意图

A泳道 C泳道 G泳道 T泳道

ACGTTGCACGTA

ACGTTGCACGT

ACGTTGCACG

ACGTTGCAC

ACGTTGCA

ACGTTGC

ACGTTG

ACGTT

ACGT

ACG

AC

A

1.2 化学裂解法

首先对待测DNA单链单侧末端进行放射性标记，再分成4～5个反应体系，分别用不同的化学试剂处理，DNA片段分别于某一种或某一类碱基处断裂，而断裂的碱基随机发生于DNA片段上某种或某类碱基中的任何一个,且每一个DNA分子只有一处断裂点。电泳后，放射自显影得到相互错落的梯形图谱，即可读出DNA序列。

1.2.1 原理

G反应：硫酸二甲脂(DMS)使鸟嘌呤N7甲基化。

A+G反应：甲酸使嘌呤环的氮质子化而使糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶取代。

C+T反应：肼裂解嘧啶环，导致其脱落。

C反应：在一定浓度的NaCl存在时，肼只对胞嘧啶起作用。

以上反应完成后，吡啶在加热条件下导致被修饰碱基处磷酸二脂键断裂。

1.2.2 操作步骤

• A 待测单链DNA的纯化和标记

• B 碱基的特异性修饰

• C .碱基的裂解

• D 上样电泳

• E 测序图谱识读

1.2.3 化学裂解法的特点

优点：

所测序列直接来源于所测DNA，避免了DNA复制中错误dNTP的掺入。

可直接对合成的寡核苷酸测序，可分析甲基化修饰等，以及研究DNA的二级结构及蛋白质与DNA的相互作用等。

缺点：操作复杂，读序困难。

1.3 杂交测序

1.3.1 原理

杂交测序是以基因芯片为基础的一种测序方法，将一段DNA片段分解为一系列相差一个碱基的八聚体，将这些八聚体做成基因芯片与待测DNA杂交，根据杂交结果拼凑出所测DNA序列。见下图

TCACGATCCTTAGGCAC 测序模板

• AGTGCTAG

• GTGCTAGG

• TGCTAGGA

• GCTAGGAA

• CTAGGAAT

• TAGGAATC

• AGGAATCC

• GGAATCCG

• GAATCCGT

• AATCCGTG

1.3.2 DNA测序分析

ABI PRISM 310遗传分析仪可用于DNA测序分析，四种双脱氧核苷酸碱基带有四种不同的荧光染料，利用双脱氧末端终止法测序。经过一根盛有变性聚丙烯酰胺凝胶的毛细管电泳，长短不同的DNA片段依次通过激光检测窗口，由CCD摄像机收集荧光信号，再由机算机测序分析软件对所收集的信号进行分析。