生物技术通报

・研究报告・

BIOTECHNOLOGY　BULLETIN

2009年第8期

土壤中脂肪酶产生菌的筛选、鉴定及脂肪酶基因的克隆

玄国营　陈芳　李予霞　高剑峰

(石河子大学生命科学学院,石河子832003)

　　摘　要:　以橄榄油为惟一碳源进行富集培养、以罗丹明B;利用滴定法、平板扩散法以及转酯反应试验,B2进行形态学观察,生理生化测定以及16SrDNA特征片段比较分析,初步确定B2)。通过特定引物PCR扩增得到B2菌株两个脂肪酶基因K1和K2。()2SO4,以叔丁醇为溶剂,催化棉籽油与甲醇反应,关键词:　　脂肪酶基因

Screening,IdentificationandLipaseGene

CloningofSoilLipaseProducingStrain

XuanGuoying　ChenFang　LiYuxia　GaoJianfeng　

(CollegeofLifeScienceofShiheziUniversity,Shihezi832003)

　　Abstract:　Usingoliveoilassolecarbonsourceinenrichmentculture,andRhodamineBasindicatortoscreening,onelipase2

producingstrainB2withhigherlipaseactivitywerescreened.B2strainwasidentifiedasKlebsiellasp.accordingtomorphologicalob2servation,determinationofphysiologicalandbiochemical.Thepart16SrDNAwasamplifiedbyPCRandsequenced.Bydesigningspecificprimers,twolipasegenesK1andK2inB2strainwasamplifiedbyPCRandsequenced.Thelipasecancatalyzecottonoilandmethanolintobiodiesel,whentert2butylalcoholassolventandacetoneand(NH)2SO4sedimentationmethodinvolvedin.

Keywords:　Biodiesel　Klebsiellasp.　Lipase　Lipasegene

　　脂肪酶(lipase,EC3.1.1.3),又称三酰基甘油

酰基水解酶,广泛存(在于动植物和微生物体内。脂肪酶不仅可水解三酰甘油生成二脂酰甘油和脂肪酸(其中的二脂酰甘油可进一步被水解为一脂酰甘油、甘油和游离脂肪酸),并且能催化水解反应的逆

[1]

反应酯化反应。目前脂肪酶生产主要有提取法

[2]

和微生物发酵法。由于微生物脂肪酶种类多,作用温度及pH范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高,并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂,因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源。近年来,非水相酶学和界面酶学的研究进一步拓展了脂肪酶的应用领域、利用脂肪酶在有机相催化的各种反应可以合成许多高价值产物,在食品、皮

革、医药和洗涤剂等许多工业领域中均有广泛的应

[3,4]

用,充分显示了其巨大的应用潜力。

目前国内外对野生微生物脂肪酶的研究与开发较为活跃。报道了新疆克拉玛依及石河子地区高脂

[5～7]

肪酶活性细菌菌株的筛选分离、鉴定以及相应脂肪酶基因的克隆等方面的研究结果。

1　材料与方法

111　材料

11111　土样　土样采集于新疆克拉玛依油田,新疆

石河子汇昌粮油公司等地,共25份土样。11112　培养基组成　富集培养基:(NH4)2SO40.1g,NaCl0.05g,MgSO4・7H2O0.01g,K2HPO40.1g。用6mol/LNa2CO3调pH为7.0,再加入1%橄

收稿日期:2009204230

基金项目:兵团博士资金项目

作者简介:玄国营(19812),男,山东潍坊人,硕士生,从事生物能源及分子免疫和育种方面研究;E2mail:tutuwaityou@163.com通讯作者:高剑峰,男,教授,博士,E2mail:135********@163.com

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-1

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榄油,蒸馏水100ml。121℃蒸汽灭菌20min。

平板初筛培养基:(NH4)2SO40.2g,NaCl0.05g,MgSO4・7H2O0.05g,K2HPO40.1g,琼脂1.2～1.8g,用6mol/LNa2CO3调pH为7.0,灭菌后再加入橄榄油聚乙烯醇乳化液。

罗丹明B显色培养基:将橄榄油与2%的聚乙烯醇溶液按1∶3(v/v)混合,4℃静置1h后于组织搅拌机中高速匀浆3min即得,加入量为每100ml养基中加入12ml橄榄油乳化液。培养基中加入10ml(0.1示剂。

复筛培养基:1.g,蛋白胨1.0g,酵母膏0.5g,H2O100ml,pH7.011113　扩增引物　利用Primer5.0引物设计工具,针对筛选到的菌株,在GenBank中BLAST相应脂肪酶基因的保守区域进行引物设计,共设计两对引物,分别是K1和K2。K1:F5′2GTGTCATGTGTCTCTGGAGC23′,R5′2TTAAAAATTGGCGCTGACCC23′;K2:F5′2ATGAAGCATCTATTTCGA23′,R5′2TCACGGTTT2GTCCGCCTG23′。由北京华大基因研究中心合成。11114　主要试剂　橄榄油、聚乙烯醇(聚合度1750±50)、RhodamineB等购自上海国药集团。PCR反应所需的试剂购自Fermentas公司,pGM2T克隆试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。11115　主要仪器　2216K高速冷冻离心机购自德国Sigma公司,Bio2Rad凝胶成像系统购自美国Bio2Rad公司,Agilent1200高效液相色谱仪购自美国Agilent公司,PCR扩增仪购自美国Bio2Rad公司,Bio2Rad电泳槽购自美国Bio2Rad公司。112　方法11211　富集方法　将采集的土样各称5g溶于10m无菌水中,充分摇匀,静置片刻,让较大土壤粒沉

菌水中稀释成10,依次稀释到10,取10,

-6-7

10,10三个梯度各200μl,分别涂布在罗丹明B显色培养基中。30℃培养箱中培养2～3d。11213　复筛方法　,在紫外灯波长为365nm下观察,化。将纯化好的菌250ml三角瓶30℃培养48h。

[8]

14　脂肪酶提取　主要包括胞内酶粗提和胞外酶提取,胞内酶用于酶活测定。11215　脂肪酶活力测定　(1)平板扩散法检测酶活:在已制成的固体琼脂平板上用打孔器开孔,直径为3.5mm。打孔后将30μl待测酶液加入孔中,置于30℃恒温培养箱中一定时间,定时观察孔周围的变色情况。(2)酸碱滴定检测酶活:将橄榄油乳化液作为反应的底物,将乳化液与pH7.2的Tris2Cl缓冲液以体积比为4∶5混合,作为反应液。在反应液加入1ml酶液启动反应,40℃反应10min,加入15ml无水乙醇终止反应,再加20ml无菌水稀释体系。对照组中应在加酶液之前先加无水乙醇。在上述反应条件下,以每分钟催化水解脂肪产生1μmol的脂肪酸所需要的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U),单位为U/ml。11216　菌株生长曲线的绘制　用接种环挑取平板上少许细菌B2,接种到装有250mlLB液体培养基的500ml三角瓶中,此时LB液体培养基清澈无比。于30℃,150r/min下摇床培养。取刚接种时的样品作为空白对照。前8h每2h取样一次,8h后每隔1h取样一次,20h后每隔2h取样一次,每次取样5ml,取好的样品放在4℃冰箱中保存,待取样时间至52h后,将所有样品用可见分光光度计波长600nm测定OD值。以培养时间为横坐标,OD值作纵坐标绘制生长曲线。11217　菌种鉴定　根据文献[9]和[10]的方法进行特性鉴定,并以《伯杰氏细菌鉴定手册(第8

[11]

版)》作为分类参考。并对活性较高的菌株B2进行16SrDNA特征片段进行PCR及测序。11218　脂肪酶基因的克隆　脂肪酶基因的扩增及纯化:K1、K2两对引物扩增体系20μl包括:10×TaqDNA聚合酶buffer2μl,基因组DNA2μl,5′2

淀后,取上层液体1ml于装有20ml富集培养基的

100ml三角瓶中,30℃,180r/min,振荡培养2d后,将富集培养基摇匀,取1ml转接到新的富集培养基中,二次富集,同样条件下振荡培养2d后,进行3次富集。在培养的过程中,每24h要观察培养基的pH下降情况,理论上pH下降越大越优。用6mol/LNa2CO3调至初始pH继续培养。11212　初筛方法　取富集菌液1ml加入到9ml无

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Primer(10pmol/L)1μl,3′2Primer(10pmol/L)1μl,

dNTPmix(1.25mM)0.8μl,MgCl2(25mM)1.2

μl,TaqDNA聚合酶(1U/μl)0.5μl,ddH2O11.5μl。引物K1、K2PCR扩增反应条件:94℃预变性温度5min;94℃变性温度30s;54℃退火温度50s;72℃延伸温度60s;反应30个循环,延伸7min后终

止反应。扩增完毕用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化。

脂肪酶基因与T载体的连接:5μl)×T4LonPGM2T载体(50ng/

l1μl,ddH2O2μl,Buffer1μl,T4DNA1Total10μl,16℃用无菌牙签挑取白斑菌落,接种于新LB液体培养基中37℃,150r/min振荡培养过夜。取2μl培养好的菌液为模板进行菌落PCR。菌落PCR扩增反应条件同上,扩增完毕统一用1%琼

图1　紫外灯波长为365nm下产生的荧光物质

脂糖凝胶电泳检测PCR产物。挑取PCR鉴定为

阳性的转化子送往北京华大基因生物科技有限公司测序。11219　生物柴油的制备及检测　利用提取到粗脂肪酶催化棉籽油与甲醇发生转酯反应生成脂肪酸甲酯。反应体系:(1)溶剂:叔丁醇12ml,棉籽油9g,甲醇2.5ml,粗酶0.432g。(2)反应条件:30℃,200r/min,反应时间24h。(3)试验方法:采用分步加入甲醇法,8h/次。分3次加完。(4)产物分析:薄层层析法、高效液相检测。(5)吸附剂:硅胶G,105℃活化30min。(6)展层剂∶石油醚∶乙醚∶醋酸=85∶15∶1。(7)显色剂:碘。(8)点样量:取1μl产物,加入9μl乙醚稀释,上样5～10μl。

图2　平板扩散法产生的变色圈表1　酸碱滴定测定胞外脂肪酶的活力结果

菌株编号

B1B2B3B4B5B6B7B8

酶活(U/ml)

5.129.026.717.128.323.213.092.90

2　结果

211　筛选结果

采集的土样在pH值为7.0和以橄榄油为唯一碳源的富集培养基富集后,经过适当稀释涂布分离平板,挑选有荧光圈(图1)的菌落涂布初筛平板,然后挑选有较大透明荧光变色圈(图2)的进一步复筛。初筛共挑选得到单菌落60余株,复筛发现60余株菌株均具有一定的产酶能力,产酶能力较高者共有8株,其中B2、B5菌株活力较高,胞外酶活性分别为9.02U和8.32U(表1)

。

图3　B2菌株的生长曲线

212　B2菌株的生长曲线

对酶活最高的B2菌株进行研究,绘制菌株B2

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生长曲线(图3)。从图中可以看出,B2菌株的生长曲线呈抛物线状,可以较清晰的看出菌株生长的4个时期:分别为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。213　菌种鉴定根据《常用细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》对B2进行各项生理生化特性分析,分析结果见表2,对该菌16S保守DNA序列进PCR扩增并测序,将测序结果在,上,最终确定B2sp.),将测序结注册,注册号是FJ615552。

表2　部分生理生化试验结果

性质

产芽孢革兰氏染色运动性过氧化氢酶40℃生长

形成二羟丙酮　注:+表示阳性

B2-+-+++

1.阴性对照;2、3.B2PCR产物;M.DNAMarkerⅢ

图5　K1为引物PCR扩增结果

性质

抗溶菌酶(0.001%)

pH5.7培养基在NaCl(10%)甘露醇

还原NO3-NO2-酪素水解

B2++++++

1.阴性对照;2、3、4.B2PCR产物;M.DNAMarkerⅢ

此菌在固体琼脂LB培养基上生长良好,形状

为长直杆状,直径为0.3～1.0mm,长度为0.6～6.0mm,可单独存在或以成对、短链状排列,不具有运动性。菌落最初形成表面光滑、凸起、微透明、粘稠状,培养24h后菌体表面出现褶皱、干燥且不透明(图4)

。

图6　K2为引物PCR扩增结果

215　阳性转化子的菌落PCR鉴定结果

分别以K1、K2为引物,菌落PCR鉴定外源基因是否连接到PGM2T克隆载体,结果(图7,图8),表明之前扩增得到的600bp左右和1600bp左右产物已经连接到PGM2T克隆载体,并且转入大肠杆菌DH5a

。

图4　菌株B2的菌落形态及菌体形态

214　脂肪酶基因的PCR扩增结果

以K1、K2为引物,以菌株B2体内基因组为摸

板,PCR扩增后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,分别得到600bp左右(图5)和1600bp(图6)左右的产物,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收此片段

。

1、2.菌落PCR产物3.阴性对照;M.DNAMarkerⅢ

图7　K1T载体转化子菌落PCR鉴定结果

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果,从图10可以看出,B2中提取到的脂肪酶具有转

酯活性,其催化棉籽油和甲醇所产的脂肪酸甲酯中含量最多为亚油酸甲酯。该微生物脂肪酶可望在工

[12～15]

业中得到广泛应用。

1.阴性对照;2、3.菌落PCR产物Ⅲ

图8　T216　质粒测序结果

将K1、K2测序结果在NCBI的GenBank中进行

BLAST,K1与GenBank序列中克雷伯氏菌的MGH78578区段上的一个CDS同源性达99%,将测序结

图10　高效液相检测菌株体内胞内酶转酯活性结果

果在GenBank上注册,注册号是FJ615553;K2与

GenBank序列中克雷伯氏菌的MGH78578区段上的另外一个CDS同源性达98%,将测序结果在GenBank上注册,注册号是FJ615554,而克雷伯氏菌的MGH78578区段是一个推定的脂肪酶基因区段。217　催化棉籽油生产生物柴油及检测

按照复筛培养方法发酵培养B2菌株,用于提取B2菌株内粗酶,即胞内酶。反应体系进行转酯反应。用薄层层析法检测菌株转酯活性,结果如图9。箭头所指为脂肪酸甲酯

。

3　讨论

从土壤中筛选出有脂肪酶活性的菌株60余株,其中8株活性较高。通过对活性较高的菌株B2进行形态学观察,生理生化测定以及16SrDNA特征片段比较分析,初步确定B2为克雷伯氏菌属(Kleb2siellasp.)。通过设计特定引物,从B2菌株基因组中扩增出全长为582bp和1623bp的两个脂肪酶基因。这两个基因都属于克雷伯氏菌的MGH78578区段上的CDS。发酵培养B2菌株提取粗酶,

胞内酶,进行转酯反应,通过薄层层析和高效液相检测,发现从B2中提取到的胞内酶具有转酯活性。目前研究表明克雷伯氏菌的MGH78578区段是一个推测的脂肪酶基因区段,相信对该区段深入研究在生物酶法制备生物柴油方面以及其他工业应用方面必将会有更大地发现。并且为今后在分子水平上对酶进行改造、提高酶转酯活性等做准备工作。

参考文献

1　张树政,酶制剂工业[M].北京:科学出版社,1984,655～668.2　谈重芳,王雁萍,陈林海,等.食品工业科技.2006,27(7):193～1953　SharmaR,ChistiY,BanerjeeUC.BiotechnologyAdvance,2001,

(19):627～662.

4　王小芬,张艳红,王俊华,等.科技导报,2006,24(2):10～12.5　张搏,杨江科,苏华武,等.生物技术,2007,(1):23～266　胡昭阳,产脂肪酶菌株的筛选及酶法合成单甘酯[硕士学位论

1.阴性对照;2.B2菌脂肪酶;3.阳性对照(NOV435)

图9　薄层层析法检测菌株转酯活性

文].南宁:广西大学,2004.

用高效液相检测菌株体内胞内酶转酯活性结

(下转第150页)

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30余条脂肪酶基因,构建了部分高效工程菌。初步研究表明,白地霉(G.candidumY162)脂肪酶和洋

8　FullerNJ,MarieD,PartenskyF,etal.AppliedandEnvironmental

Microbiology,2003,69(5):2430～2443.

9　MummeyDL,StahlPD.MicrobialEcology,2004,48(1):41

葱假单胞菌G63脂肪酶具备优良的有机溶剂耐受

性和热稳定性,是生产生物柴油的优良催化剂,在工

[15,19]

业上极具应用开发潜力;黑曲霉F044和白地酶Y162具极强的底物特异性,能选择性水解或酯化获得高营养价值的多不饱和脂肪酸(FUFAs),在

[15,18]

功能食品开发中显示出诱人的前景。

参考文1　MacraeAR,Ha&Engineering

Reviews,1985,6:8552　JaegerKE,EggertT.CurrentOpinioninBiotechnology,2002,13

(4):390～397.

3　魏红明,赵华.当代化工,2006,35(4):246～249.

4　Hagstr mA,PommierT,RohwerF,etal.AppliedandEnviron2

mentalMicrobiology,2002,68(7):3628～3633.

5　DrancourtM,BolletC,CarliozA,etal.JournalofClinicalMicro2

biology,2000,38(10):3623～3630.

6　OlsenGJ,WoeseCR.Cell,1997,89:991～994.

7　HugenholtzP,HuberT.InternationalJournalofSystematicandEv2

olutionaryMicrobiology,2003,53:289～293

～50.

10　KumarM,ShuklaPK.JournalofMicrobiology,2005,43

(2):662～668.

11iHC,,ofMedicalMicrobiol2

57:592～600.

SE,HobanDJ,etal.JournalofClinicalMi2

ogy,1999,37(6):1846～1851.

13　KoukerG,JaegerKE.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,

1987,53(1):211～213.

14　郑维,权春善,朴永哲,等.中国生物工程杂志,2006,26(4):75

～80.

15　阎金勇,杨江科,徐莉,等.微生物学报,2008,48(2):184

～190.

16　QiZT(齐祖同),AspergillusetTeleomorphiCognati.In:FloraFun2

gorumSinicorum.Beijing:SciencePress,1997,5.

17　AccensiF,CanoJ,FigueraL,etal.FEMSMicrobiologyLetters,

1999,180(2):191～196.

18　舒正玉,杨江科,徐莉,等.武汉大学学报(理学版),2007,53

(2):204～208.

19　杨江科,郭道义,闫云君.高技术通讯,2007,17(2):175～179.

(上接第143页)

7　张金伟,曾润颖.生物磁学,2006,6(1):6～10.

8　马歌丽,董文惠,等.现代食品科技,2007,23(8):17～19.9　中国科学院微生物研究所,细菌分类组:一般细菌常用鉴定方

12　MateosJC,RuizK,RodriguezJA.JournalofMolecularCatalysisB:

Enzymatic,2007,49(16):104～112.

13　ShinobuOda,KunioIsshiki,Liquid2surfaceImmobilizationSystem

andLiquid2liquidInterfaceBioreactor:ApplicationtoFungalHydrol2ysis.[M]ProcessBiochemistry,2007,42(11):1553～1560.14　GómezdeMembrillera,JoaquínGarcíaBox.JournalofBiotechnolo2

gy,2007,131(2):90～91.

15　FlorczakT,MakowskiK,TurkiewiczM.JournalofBiotechnology,

2007,131(2):89～90.

法.北京:科学出版社,1978.

10　GerhardtP主编,厦门大学生物系微生物学教研室译.普通细菌

学方法手册.厦门:厦门大学出版社,1989.

11　BuchananRE,GibbonsNE,Bergey′sManualofDeterminativeBac2

teriology(8thed).NewYork:WilliamsandWilkins,1974.