蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）

1、 取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、 设计蛋白表达引物。引物要去除信号肽，要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、 RT-PCR，KOD酶扩增获取目的基因c DNA.

4、 双酶切，将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、 转化到DH5α感受态细菌中扩增，提质粒。

6、 将质粒转化入表达菌株，挑菌检测并保种。表达菌株如Bl21（DE3）、Rosetta gami（DE3）、Bl21 codon（DE3）等。

7、 蛋白的诱导表达。

1） 将表达菌株在3ml LB培养基中摇至OD=0.6左右，加入IPTG，浓度梯度从25μM到1m M。37度诱导过夜(一般3h以上即有大量表达)。

2） SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。注：目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体蛋白的50%以上，在胶上可以看到明显的粗大的条带。

动等原因，要及时调整。溶液由浑浊变清透，由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时，如果沉淀少说明裂解的好）。5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。

注意：1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解，在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF），PMSF工作浓度为1%。2.如不能判断是否裂解完全，就按上述条件裂解60分钟，60分钟足够裂解。

8、 取得上清

1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。10000rpm，15min，4°离心。沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。）

9、 纯化上清---摸洗脱条件。

1） 镍柱处理。将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2） 将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

3） 分别加20mM、40mM、60mM、80 mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

注意：理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。

4） 加Elution Buffer 将目的蛋白洗脱。上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

5） 加MES将NI柱重生。MES加10ml，流完后再加10ml Miliq H2O。流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。（尿素可能对NI柱有损伤。）

注意：所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余Equilibration Buffer pH=7.8 ，上清 pH=7.5 ，Wash Buffer pH=7.0 ，Elution Buffer pH=7.2。

10、 跑胶验证。

1） 跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2） 跑胶顺序：负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES

3） 300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。）

4） 考马斯亮蓝染色。一般染色2h即可。

5） 脱色。先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

11、 纯化上清---收集目的蛋白

1) 将重生的镍柱再次平衡（即加Equilibration Buffer 3ml）。

2) 重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

12、 跑胶验证。同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。

13、 透析。

1） 配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2） 透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQ H2O充分洗净。

3） 用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mM PBS+50 mM NaCl）中。冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。透析3次即可。

注意：用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。冰浴以防活性降低。

14、 浓缩。

1） 将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2） 30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。

3） 每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4） 透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°存放。

注意：浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。

15、 超滤法浓缩、透析蛋白。使用超滤法就可省去16、17两步。

1） 将4ml Elution 得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2） 配平。

3） 7400g，30min，4°离心，结束时4ml变为1ml左右。浓缩4倍。可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。可以几次的Elution液一起浓缩。

4） 加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。蛋白储存液一般用20mM PBS+*mM NaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

5） 收集。将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度（测量后），制备日期。

注：超滤管的使用方法见附件4

16、 蛋白浓度测定。见附件3

17、 蛋白活性测试。转染细胞测量荧光。

18、 抗原处理。蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

19、 注射兔子。选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

20、 收集免疫血清。提取抗体。

21、 抗体效价评定。

附件1

所需溶液配方：

1) 20 mM PBS: 20 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl pH 7.4

2) Equilibration Buffer（平衡缓冲液）: PBS with 10 mM 咪唑 pH 7.4

3) Wash Buffer（清洗缓冲液）: PBS with 25 mM/50 mM/75 mM 咪唑 pH 7.4

4) Elution Buffer（洗脱缓冲液）: PBS with 250 mM 咪唑 pH 7.4

5) MES（再生缓冲液）: 20 mM 2-(N-morpholine)-ethanesulfonic acid, 0.1 M sodium chloride; pH 5.0。即0.3904g MES+0.5844g NaCl.

6) 透析袋处理液：  2%（w/v）碳酸氢钠和 1 mmol/L (pH8.0) EDTA

7) 透析液：20mM PBS+50 mM NaCl（2.92g）

TIPS:1—4的溶液可以一起配制。先配10ml 8M的咪唑。再配1L的PBS，用500ml水将试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为Wash Buffer、Elution Buffer和Equilibration Buffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。最后，定容。Wash Buffer、Elution Buffer各配了100ml，Equilibration Buffer配了300ml。PBS配了500ml。

附件2

包涵体检测

1. 摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜(也可不离心,在原来LB中直接加IPTG)。在离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。

2. 诱导完成后，用2ml EP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。1.5mlPBS (50m M PBS,300m M NaCl )重悬细菌。

3. 裂解细胞。 用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。裂解3s，停止6s，裂解时冰上放置。

4. 分离上清。5000rpm，4min，4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。然后，10000rpm，10min，4度。取上清于新的1.5mlEP管中。取其中的20微升于200微的EP管中，加5微5*SDS loading buffer混匀，煮沸10min。

5. 重悬包涵体。 用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloading buffer，煮沸10min。

6. 正负对照的收集。离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40μl,加入10μl5*SDSloading buffer,煮沸10min裂解。

7. 跑聚丙烯酰胺凝胶。将正负对照及实验样品一起跑胶。一般顺序是: -,+,上清,包涵体.

附件3

蛋白浓度定量测试方案

1．将染色剂稀释。

稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16ml miliq H2O.充分溶解后用0.44μm的滤膜过滤于另50ml离心管中。(此剂量可测4个样品。)

2．牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备

1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500μl/支(可以室温放置60天，-20度长期保存)。

2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180μl，另外加一管水为零对照。

3．染色。

1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。4个梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品(或1+n个样品)和1个blank，共10支EP管(或10+n支)，分别对应标记。

2）将30μl样品和30μl标准BSA及30μl H2O分别加入上述EP管中。涡旋混匀。

3）室温孵育5min到60min。5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为Absorbance wil increase over time。

4. 吸光度的测量。 600nm处测量，并记录吸光度。注意：1. blank是染色液加30微升的水。2.从低浓度测量到高浓度。根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测量顺序。

5. 比色皿的洗涤。 用100%乙醇浸泡洗涤。

6. 标准曲线的制作。利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4.

4ml millipore超滤离心管使用注意事项

1. 用前用miliq 水润湿。

2. 4度预冷。

3. 离心力不能超过7500g。加速度设定为8.

4. 离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一致。

5. 使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml 0.1N NaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存。如果要短期保存几天，也可加水浸泡。

附件5

聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法

附件6.

包涵体蛋白的提纯

与提上清中所用试剂不同之处：在Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中各加了6M尿素或盐酸胍。尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。在裂解完后，离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。用加了6M尿素或盐酸瓜的Equilibration Buffer溶解包涵体。后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用Equilibration Buffer 、Wash Buffer、Elution Buffer中都含有6M尿素或盐酸胍。另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。

如果要做包涵体，建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去，除去后蛋白可能就析出了。尿素毒性相对较小，可以不用除去。这样可以省去很多麻烦。尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解：6mm变幅杆，15%功率，3s/6s，10min左右即可。也可以加上1%---5%的甘油助溶。甘油是加在Equilibration Buffer中的。

另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0.6左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE

1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl 100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。

2、-20度放置10min。4度，15000rpm，10min，小心弃去上清，尽量去干净。此时管底可见蛋白沉淀。

3、向管中加30μl 1.5*SDS-loading buffer。（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。

4、上样，跑胶。

如有错误，敬请批评指正。

血清的提取

动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g，10min离心，分离出血清。

抗血清保存有三种方法：

第一种是4℃保存，通常可保存3个月～半年，效价高时可保存一年左右；

第二种是-20℃～-40℃低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；

第三种是真空冰冻干燥保存，可保存5～10年。

注：耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会溶血。