细胞色素C的制备及测定

摘要：本实验以猪心为主要原料，通过匀浆，抽滤，盐析，离心，透析等步骤提取其中的细胞色素C，并通过cytc含量测定，紫外分光光度计测定蛋白质的含量测定提取得到的细胞色素C的产量、产率和纯度，最后通过cytc溶液波峰扫描测定细胞色素C溶液的光吸收峰。测得蛋白质含量为1.288mg/ml，产量为15.11mg，产率为58.33mg/公斤，符合标准。Cytc氧化型吸收峰在410nm和530nm，cytc还原型吸收峰在410nm和530nm处。

关键词：细胞色素C 制备 产率 cytc

正文

1.前言：细胞色素C广泛存在于需氧细胞的线粒体中，是一种含血红素辅基的单链蛋白质，呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。

细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素C的含量测定。

由于细胞色素C在心肌组织中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以猪心为材料。向心肌中加入三氯乙酸溶液，一起进行匀浆，大部分的蛋白质都沉淀下来，细胞色素C则存留在三氯乙酸中。将硫酸铵粉末加入到三氯乙酸抽提液中，硫酸铵与抽提液中的肌红蛋白、血红蛋白等一起沉淀下来，细胞色素C仍留于溶液中。进一步用三氯乙酸酸化此溶液，细胞色素C就沉淀出来，然后透析并鉴定之。

鉴定及测定细胞色素C用消光法。在550毫微米波长下，细胞色素C的克分子消光值为：氧化型细胞色素C：K1=0.9*10^4/克分子/厘米

还原型细胞色素C：K2=2.77*10^4/克分子/厘米

其含义为浓度是1克分子/升或1毫克分子/毫升的氧化型细胞色素C溶液，通过1厘米的光程，其消光值为0.9*10^4。

样品较纯时，从氧化型转变为还原型或者从还原型转变为氧化型，消光值的情况相同。若样品不纯，含有其他色素，则测得的变化不可靠。

2.材料与方法

2.1 材料、仪器与试剂

材料：猪心：购于翠苑农贸市场。

仪器：（1）大烧杯，搅拌棒

(2) HR1707 飞利浦二合一搅拌机；珠海经济特区飞利浦家庭电器有限公司。

（3）LXJ-ⅡB 飞鸽牌离心机

（4）细布

（5）大玻璃漏斗，大布氏漏斗

（6）透析袋

（7）6.9-814Q/GHSC 1571-2006 PH计或PH试纸；上海三爱思试剂有限公司。

（8）uv-2100型紫外可见分光光度计；龙尼柯上海仪器有限公司。

（9）SH2-D（Ⅲ）循环水式真空泵；巩义市予华仪器有限责任公司。

（10）JB-3型定时恒温磁力搅拌器

（11）721型分光光度计

试剂：（1）10%氢氧化钠溶液（100克/升）

（2）硫酸铵粉末

（3）20%三氯乙酸溶液（200克/升）

（4）0.145mol/L三氯乙酸溶液

（5）饱和硫酸铵溶液

（6）10mol/L铁氰化钾溶液

（7）饱和连二亚硫酸钠溶液

（8）0.1mol/LPH7.4磷酸钠缓冲液

2.2 方法

2．2.1 细胞色素C的提取流程

猪心→搅碎（称重）→加入0.145mol/L TCA→抽提（1:1）→静置（2-3h）→纱布过滤→10%氢氧化钠溶液调PH7.3→加入硫酸铵（500g/L）→抽滤→上清中加入20%TCA→离心→沉淀中加饱和硫酸铵→透析除盐→离心→上清→测定、保存。

2.2.2 细胞色素C的制备操作步骤

（1）材料处理：

取猪心若干，剔除脂肪，称重，搅碎。

（2）提取：

加入等量0.145mol/L的三氯乙酸溶液匀浆，搅拌抽提10min。将此混合物抽提物于室温下放置2-3个小时，然后用两层纱布过滤。用10%氢氧化钠溶液将上述混合液调到PH7.3，测量并记录此抽提液的体积，再于搅拌下慢慢加入硫酸铵粉末（加入量按500克/升混合液计算）。用布氏漏斗抽滤，除去沉淀（经常更换滤纸，要防止倒灌），收集粉红色溶液。测量并记录此滤液的体积，搅拌下再加入硫酸铵粉末（加入量按50克/升滤液计算）。此盐析液于冰箱中放置过夜。

（3）离心，透析：

上述盐析液经放置后出现少量沉淀，用布氏漏斗抽滤（两层滤纸），除去沉淀，保留上清液，向上清液中加入20%三氯乙酸溶液（加入量按25毫升/升上清液计算），以沉淀细胞色素C。迅速地雨3500转/分条件下离心10分钟、收集细胞色素C沉淀，再将这个砖红色的沉淀悬浮于饱和硫酸铵溶液中（饱和硫酸铵的体积按150毫升/公斤心肌组织计算，可根据实验操作情况减少30%-50%）。将此悬浮液移于透析袋中，对水透析4-5小时，离心（3500转/分，10分钟）除去少量暗黄色（已变性的细胞色素C）沉淀，红色的细胞色素C则应贮于零下15℃。记录此溶液体积。

2.2．3 测定细胞色素C的产量、纯度及产率的操作步骤

以上制的的细胞色素C溶液是还原型分子与氧化型分子的混合物。用铁氰化钾氧化一份样品，用连二亚硫酸盐还原另一份样品，将这两份样品于550毫微米处的消光值记录下来。根据已知的氧化型细胞色素C及还原型细胞色素C的克分子消光值及测得的样品消光值，可以计算出每个样品相当于多少克分子（E/K）

氧化型样品的消光值E1：按下表加入试剂与样品，于550毫微米波长下测出氧化型样品的消光值。

还原型样品的消光值E2：按下表加入试剂及样品，于550毫微米波长下测出还原型样品的消光值。

2．2.4 测定产品的分光光度吸收值

将上面的氧化型及还原型溶液取来测定可见光不同波长下的吸收值，从400nm-580nm每隔10nm读数，绘出吸收曲线（波长—光密度值）。读出氧化型和还原型的分别最大吸收峰所在的波长区域。

3.结果与分析

3.1 实验数据

（1） A280=1.709 A260=1.608

（2）氧化型E1=0.151 还原型E2=0.081

（3）心肌重量=0.259公斤

（4）不同波长下氧化型和还原型的分光光度吸收值：

3.2 实验结果

3.2.1蛋白质含量mg/ml=1.45*A280-0.74A260=（1.45*1.709-0.74*1.608）mg/ml=1.288mg/ml

3.2.2 Cytc 含量

Y1=E1/K1*Mwt*3Vml*稀释倍数=0.151/0.9*10^4*12400*3*35.9=22.4064mg

Y2= E2/K2*Mwt*3Vml*稀释倍数=0.081/2.77*10^4*12400*3*35.9*2=7.8104mg

产量=1/2（Y1+Y2）=1/2(22.4064+7.8104)mg=15.1084mg

心肌重量=0.259公斤

产率=产量（毫克）/心肌重量（公斤）=15.1084/0.259=58.33mg/公斤

3.2.3 细胞色素C氧化型和还原型分子在不同波长下的光吸收值见图a-b

图a：

图b:

由图可知，Cytc氧化型吸收峰在410nm和530nm，cytc还原型吸收峰在410nm和530nm处。

3.2.4 实验分析

1. 产率=58.33mg/公斤>50mg/公斤，符合实验要求。

2. Cytc氧化型吸收峰在410nm和530nm，cytc还原型吸收峰在410nm和530nm处。基本符合氧化型的最大吸收峰在408微毫米，530微毫米，还原型的最大吸收峰在415微毫米，520微毫米，550微毫米的要求。

3.用10%氢氧化钠溶液调PH到7.3，是为了除肌红蛋白和血红蛋白。而加入硫酸铵粉 末是为了盐析，除杂蛋白。

参考文献

1.张燕平；生物化学实验指导；浙江工商大学出版社；2009年12月

2.《基础生物化学实验》王秀奇等编,高等教育出版社,1999年