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    第50卷第11期2019年11月东北农业大学学报JournalofNortheastAgriculturalUniversity50(11:53~60November2019网络出版时间2019-11-2616:05:39[URL]http://kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20191126.1605.008.htmlCiF3H基因克隆及功能分析杨飞芸1,2，白洁1，杨天瑞1，王瑞刚1*（1.内蒙古农业大学生命科学学院内蒙古自治区植物逆境生理与分子生物学重点实验室，呼和浩特2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，呼和浩特010018）010011；摘要：黄烷酮-3-羟化酶（F3H）是类黄酮合成途径的中枢位点，调控代谢途径中黄酮醇和花青素合成。文章根据转录组数据库中F3H基因中间片段设计特异引物，以中间锦鸡儿cDNA为模板，克隆得到CiF3H基因全长，通过序列分析、系统进化分析加以确认。qRT-PCR检测分析发现，中间锦鸡儿CiF3H基因受紫外、NaCl和ABA等胁迫诱导时表达模式具有相同规律。CiF3H基因在叶和根中表达量相当，茎中较少。异源表达CiF3H基因拟南芥的总黄酮含量少量增加，花青素含量降低。关键词：黄烷酮-3-羟化酶（F3H）；中间锦鸡儿；总黄酮含量；花青素含量；转基因拟南芥中图分类号：Q71文献标志码：A文章编号：1005-9369（2019）11-0053-08杨飞芸,白洁,杨天瑞,等.CiF3H基因克隆及功能分析[J].东北农业大学学报,2019,50(11:53-60.DOI:10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.11.0007YangFeiyun,BaiJie,YangTianrui,etal.CloningandfunctionanalysisofCiF3Hgene[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity,2019,50(11:53-60.(inChinesewithEnglishabstractDOI:10.19720/j.cnki.issn.1005-9369.2019.11.0007CloningandfunctionanalysisofCiF3Hgene/YANGFeiyun1,2,BAIJie1,YANGTianrui1,WANGRuigang1(1.SchoolofLifeSciences,InnerMongoliaAgriculturalUniversity;InnerMongoliaKeyLaboratoryofPlantStressPhysiologyandMolecularBiology,Hohhot010011,China;2.SchoolofFoodScienceandEngineering,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot010018,ChinaAbstract:Flavanone-3-hydroxyase(F3Histheessentialsiteinflavonoidsbiosynthesispathway,whichregulatesthesynthesisofflavonolsandanthocyaninsinthewholemetabolicpathway.Inthisstudy,specificprimersweredesignedaccordingtotheintermediatefragmentofF3Hgeneinthetrans-criptomedatabase,andthefulllengthofCiF3HgenesequencewasclonedusingCaraganaintermediacDNAastemplate,whichwasconfirmedbysequenceandphylogeneticanalyses.TheexpressionofCiF3Hhadthesamepatternbyultraviolet(UV,NaClandabscisicacid(ABAstressesasrevealedbyquantitativereal-timePCR(qRT-PCR.TheexpressionofCiF3Hwassimilarinleavesandroots,butlessinstems.ThecontentoftotalflavonoidsintransgenicArabidopsisincreasedslightly,butthecontentofanthocyaninsdecreased.Keywords:Flavanone-3-hydroxyase(F3H;Caraganaintermedia;totalflavonoidscontent;antho-cyaninscontent;transgenicArabidopsis收稿日期：2019-10-15基金项目：国家自然科学基金项目（31360169）；内蒙古自治区自然科学基金项目（2017MS0354）作者简介：杨飞芸（1979-），女，副教授，博士，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail:yangfeiyun@imau.edu.cn*通讯作者：王瑞刚，教授，博士，研究方向为生物化学与分子生物学。E-mail:ruigangwang@126.com
    ·54·东北农业大学学报第50卷植物生长过程中的代谢活动可产生初级和次级代谢产物。次级代谢产物调节植物生长发育，增加植物抵御生物与非生物胁迫能力[1-2]。类黄酮是植物重要的次级代谢产物，具有影响种子萌发、促进生长素运输、抵御紫外线等多种氧化胁迫损伤等作用[3]。根据结构不同，类黄酮分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、花青素和异黄酮等11个亚类[4]。类黄酮是在胞浆多酶复合体催化下，经由苯丙烷代谢途径，由一系列酶催化合成[5-6]。F3H黄烷酮-3-羟化酶（Flavanone-3-hydroxyase，可将黄烷酮类底物羟基化生成二氢黄酮醇类化，EC1.14.11.9）是类黄酮代谢途径中枢位点，合物，调控代谢途径中黄酮醇和花青素合成。黄酮醇合成酶（FLS）是类黄酮与儿茶素合成的中介物质，催化二氢黄酮醇羟基化，生成黄酮醇类。黄酮醇是带有羰基的类黄酮，原花青素前体物质，存在于多种水果和蔬菜中[7]。二氢黄酮醇还原酶（DFR）是花青素合成途径起始点和关键酶，催化二氢黄酮醇还原成不稳定无色花色素[8]。黄烷酮-3-羟化酶（F3H）属于2-O-酮戊二酸和铁离子依赖的双加氧酶超家族（2-ODD），除底物柚皮素外，反应还需要2-酮戊二酸、氧、铁和抗坏血酸[9]。研究表明，F3H在大多数物种中以单拷贝形式存在，也有多拷贝形式[10]。不同物种F3H具有较高相似度，其编码区高度保守，结构和催化机制相似[11]。该基因时空表达模式差异较大，受紫外辐射、干旱、NaClLycium、温度和光照等多种因素诱导[12-13]。将枸杞chinense）F3H基因转入烟草中，过表达株系黄烷-3-醇含量增加，丙二醛和H2氧化酶活性增加，抗旱能力明显增强O2含量降低，抗[14]。转基因研究表明，抑制或过表达该基因可引起植物体内黄酮醇、异黄酮和花青素等类黄酮含量发生改变[15]。Jiang等采用RNAi技术将草莓果实F3H基因沉默，发现果实表皮大部分为绿色，果实内部大部分为白色，花青素含量明显降低[16]。Nishihara等发现白色花朵的蓝猪耳（ToreniafournieriLind.）由于F3H基因5'-端插入一段长重复序列，抑制基因表达，花朵未着色。将外源F3H基因转入，花朵呈粉红色，说明F3H基因对蓝猪耳花色形成具有重要作用[17]。中间锦鸡儿（Caraganaintermedia）是广泛分布于荒漠、半荒漠地区的豆科灌木，对各种逆境适应能力极强，作为防风固沙优良树种在西北地区广泛栽培，也是研究植物抗逆机制的优良素材[18]。中间锦鸡儿除含有丰富蛋白质、脂类、糖类等营养物质外，还有类黄酮、芪类、生物碱和萜类等多种生物活性物质，作为传统药材，其花、根、种子等部位均可入药[19-20]。为明确其抗逆机制，本研究对克隆得到CiF3H基因作序列分析和系统进化分析，研究其在紫外辐射、NaCl和ABA处理下表达模式，初步分析该基因功能。旨在为植物抗逆、类黄酮合成提供新的基因源。1材料与方法1.1材料中间锦鸡儿种子采自呼和浩特市和林格尔县经111.82°，北纬40.38°）。野生型拟南芥Arabidopsisthaliana）Columbia-0生态型（Col-0）、大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101和植物表达载体质粒pCanG-HA由内蒙古自治区植物逆境生理与分子生物学重点实验室保存。VectorT载体pMD19-T1.2方法购自TaKaRa公司。1.2.1在中国林业科学院提供柠条锦鸡儿CiF3H基因全长克隆及分析（CaraganakorshinskiiKom.）转录组数据库[21]中筛选获得F3H中间片段设计cDNA得5'-和为模板，使用5'-和3'-RACE3'-末端序列，所用引物序列见表Clontech引物，以中间锦鸡儿公司RACE试剂盒获1。通过分析、比对、拼接后得到CiF3H全长序列。PCR引物合成及产物测序由上海生工生物有限公司完成。中间锦鸡儿和拟南芥总RNA提取均采用Trizol法[22]。将CiF3H基因ORF序列在NCBI数据库中Blast比对，筛选出与其相似度最高序列开展系统进化分析。使用Primer5.0软件翻译序列。利用Mega5.0软件，Neighbour-Joining算法构建系统进化树[23]1.2.2分别对中间锦鸡儿幼苗作紫外中间锦鸡儿处理方法。（UV-C）照射（紫外光强度为NaCl（浓度为120.50.2mol·LLux，紫外灯照射距离为1m）、-1ABA）（浓度为2×10）和脱落酸（Abscisicacid，-4mol·L-1）胁迫处理。中间锦鸡儿幼苗在植物培养室（温度22℃，16h光照/8h黑暗）培养30d，长势一致。胁迫处理后取样（分别取（（东（
    第11期杨飞芸等：CiF3H基因克隆及功能分析·55·3株幼苗地上部分作为混合样品），检测CiF3H基0、0.5、1、3、6、9、12和24h。利用实时荧光定因表达量。作3次生物学重复试验。取样时间为：量PCR（Quantitativereal-timePCR，qRT-PCR）在表1Table1引物名称PrimernameLightCycler480实时荧光定量PCR仪（Roche公司）上检测CiF3H基因表达量。以CkEF1α（KC679842）作为2-ΔΔCT法计算[24]。内参基因，内参基因引物见表1。基因表达量以引物序列Primersusedinthisstudy引物序列（5'-3'）Primersequences(5'-3'RACE引物RACEprimers5'-引物3'-引物5'-引物3'-引物5'-引物3'-引物CAGTGGGGACAGTGGTGGAGATGATCACGGCTCCATAACACTGCTTCT全长引物FulllengthprimersqRT-PCR引物qRT-PCRprimersCGCCTCCCTCGTCGAAATGAGTCTTGACCAACAAGGAGTGTAGTGGATCCGTCGACTTAAACCCCTCAAATCTGTGGACGGCTCCATAACACTGCTTCTTCAACAAAAGGAACAGGAACCC内参引物InternalreferencegeneprimersCkEF1α-FCkEF1α-RAtEF1α-FAtEF1α-RCAAAAAGTCCCCTCGTTGTCTCAGCAATCGTTCTTCCTAATGATCTAAAGAAGGGTGCCAAATGATGAGGGAGGGAGAGAGAAAGTCACAGA1.2.3pCanG-CiF3H植物表达载体构建In-Fusion酶连入植物表达载体pCanG-HA，菌落PCR及双酶切验证，验证正确的重组质粒电转化农杆菌GV3101感受态细胞。1.2.4拟南芥遗传转化及纯合体筛选扩增CiF3H基因编码区（ORF），测序验证后用22.1结果与分析CiF3H基因克隆与序列分析据转录组数据库获得F3H中间片段设计引物，利用RACE技术克隆其缺失cDNA序列，分别得到518bp的5'-端和562bp的3'-端cDNA序列（见图1A）。测序分析正确后，利用VectorNTI10拼接克隆到序列片段，得到CiF3H基因cDNA全长序列。以中间锦鸡儿cDNA为模板，使用特异引物扩增其cDNA序列（见图1B），连接到克隆载体验证后，确定拼接结果正确。得到CiF3H的cDNA全长为13'-UTR为257bp，编码340个氨基酸。844bp，其中ORF为1020bp，5'-UTR为567bp，采用浸花法将重组表达载体pCanG-CiF3H转入野生型拟南芥[25]，卡那霉素（25mg·L-1）筛选阳性植株。qRT-PCR检测CiF3H在转基因株系中表达量，反应体系及反应程序参考文献[26]，引物序列见表1。作3次生物学重复试验。以AtEF1α（AT5G60390）作内参基因，内参基因引物见表1。基因表达量以2-ΔΔCT法计算，选取3株表达水平较高的株系开展后续表型试验。1.2.5转基因拟南芥总黄酮含量检测2.2CiF3H蛋白系统进化分析剪取正常条件下（22℃，16h光照/8h黑暗）生为进一步了解CiF3H与其他物种该类基因之间进化关系，将CiF3H蛋白序列与其他物种F3H蛋白序列比对分析，构建系统进化树（见图2）。进化分析结果表明，中间锦鸡儿CiF3H与大豆（Glycinemax）F3H（Glyma.02G048600和Glyma.16G128700）构成一个分支，亲缘关系最近；与其他豆科植物，如蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）、鹰嘴豆（Cicerarietinum）和木豆（Cajanuscajan）F3H亲缘关系较远。进化树使用序列均为NCBI中注释为F3H的基因，确定CiF3H为该基因家族成员。长40d拟南芥植株地上部分，每个株系取3株，液氮研磨成粉末。硝酸铝比色法测定总黄酮含量[26]。作3次生物学重复试验。1.2.6转基因拟南芥花青素含量检测取正常条件下生长40d拟南芥植株地上部分，每个株系3株，液氮研磨成粉末。准确称取0.5g研磨后样品，5%HCl-80%甲醇溶液4℃浸泡过夜，12000r·min-1离心20min，530nm处测定吸光值，计算花青素含量[27]。作3次生物学重复试验。
    ·56·东北农业大学学报第50卷A12M31000bp4BM121000bpA-CiF3HRACE扩增结果，1、2为5'-RACE扩增产物，3、4为3'-RACE扩增产物；B-CiF3H全长结果；M-DL5000MarkerA-CiF3H5'-RACE(Lane1,2and3'-RACE(Lane3,4;B-CiF3HcDNA;M-TaKaRaDL5000Marker图1CiF3H基因克隆电泳结果Fig.1ResultsofgenecloningandgelelectrophoresisofCiF3HCicerarietinum（Ca09973.g）Medicagotruncatula（Medtr8g075890）Medicagotruncatula（Medtr3g058610）7876Medicagotruncatula（Medtr8g075830）94Cicerarietinum（Ca01969.g）Medicagotruncatula（Medtr5g022020）96100Glycinemax（Glyma.01G566200）Oryzasativa（LOCOs04g56700）Arabidopsisthaliana（AT3G51240）Cicerarietinum（Ca09972.g）Cajanuscajan（C.cajan43594.g）100（Glyma.02G048400）100Glycinemax（CiF3H）●CaraganaintermediaGlycinemax（Glyma.02G048600）5194100Glycinemax（Glyma.16G128700）510.299图2CiF3H与其他物种来源的F3H构建系统进化树Fig.2PhylogenetictreeconstructedwithCiF3Handthisgenefromotherspecies2.3不同胁迫处理下CiF3H基因表达分析黄烷酮-3-羟化酶催化黄酮醇、花青素等生不同程度表达。实验室种植中间锦鸡儿幼苗中，CiF3H基因在叶和根表达量接近，茎中最少。采自野外的组织中，CiF3H基因在种子中表达量相对较高，花中表达量低。成，增强植物抵御各种逆境能力。为研究CiF3H基因经不同逆境处理表达情况，分析其在不同逆境中作用，本研究利用qRT-PCR技术检测CiF3H基因在紫外、NaCl和ABA等胁迫处理下表达模式，结果见图3。检测结果表明，紫外照射处理和NaCl处理时，CiF3H基因表达量呈先降后升，降低再升高趋势；ABA处理时，CiF3H基因表达量呈先降低后升高又降低趋势。2.5pCanG-CiF3H植物表达载体构建及转基因纯扩增CiF3H基因编码区，连接到pEASY-Blunt合体植株鉴定Simple克隆载体，测序正确后用SpeⅠ和HindⅢ双酶切，连接到pCanG-HA表达载体中。经双酶切鉴定，切出目的片段，表明载体构建成功（见图5A）。通过农杆菌介导的浸花法获得转基因纯合体2.4CiF3H基因组织特异性分析由于中间锦鸡儿为多年生灌木，实验室难以获植株6株，提取转基因株系总RNA，利用qRT-PCR检测CiF3H在转基因株系中表达水平（见图5B），选取表达量较高3个株系OE-15、OE-23和OE-36开展后续表型检测试验。得花和种子。本研究以植物培养室生长30d中间锦鸡儿根、茎、叶及和林格尔县野生中间锦鸡儿植物花和种子为材料，提取其RNA，利用qRT-PCR技术检测CiF3H基因在不同组织部位表达情况，结果见图4。结果显示，CiF3H基因在被检测组织中均有2.6转基因拟南芥总黄酮含量变化按照硝酸铝比色法具体步骤绘制芦丁标准曲线。芦丁质量浓度X和吸光值Y关系为：Y=1.081X-
    第11期杨飞芸等：CiF3H基因克隆及功能分析·57·0.004，R2=0.999，表明在芦丁浓度为0~0.96mg·mL-1范围内该标准曲线线性良好。按此方法测定转基因拟南芥总黄酮含量，利用测得吸光值，根据标准曲线线性方程计算总黄酮含量，结果见图6。相对表达量（倍数）Relativeexpression(FoldA1.41.21.00.80.60.40.20由于3个过表达株系种植在不同钵中，为减少误差，在每个过表达株系钵中均种植野生型。结果表明，转基因各株系总黄酮含量较野生型均有提高。UV00.51处理时间（h）TreatmenttimeNaCl3691224相对表达量（倍数）Relativeexpression(FoldB1.61.41.21.00.80.60.40.201.41.21.00.80.60.40.2000.51处理时间（h）TreatmenttimeABA3691224相对表达量（倍数）Relativeexpression(FoldC00.5处理时间（h）Treatmenttime139A-ExpressionanalysisofCiF3HunderUVtreatment;B-ExpressionanalysisofCiF3HunderNaCltreatment;C-ExpressionanalysisofCiF3HunderABAtreatmentA-紫外处理；B-NaCl处理；C-ABA处理图3不同胁迫处理下CiF3H基因表达分析Fig.3ExpressionanalysisofCiF3HgeneunderdifferentstressconditionsbyqRT-PCR1.81.61.41.21.00.80.60.40.20相对表达量（倍数）Relativeexpression(Fold叶根茎组织部位Tissues花种子图4Fig.4CiF3H基因组织特异性表达分析ExpressionanalysisofCiF3HgeneindifferenttissuesbyqRT-PCR
    ·58·东北农业大学学报第50卷AM123B相对表达量（倍数）Relativeexpression(Fold2520151050OE-15丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆750bpOE-15OE-36丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆OE-46OE-9OE-23丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆转基因株系TransgeniclinesA-M为DL2000Marker；1为pCanG-CiF3H重组质粒；2、3为pCanG-CiF3H重组质粒被SpeⅠ和HindⅢ双酶切；B-转基因株系CiF3H基因表达水平A-1-Vectorcontrol;2,3-EnzymaticdigestionproductswithSpeIandHindⅢofpCanG-CiF3H;M-TaKaRaDL2000Marker;B-DetectionofCiF3HexpressionlevelintransgenicArabidopsis图5重组质粒酶切验证（A）及转基因株系CiF3H基因表达水平检测（B）Fig.5RestrictionenzymaticdigestionidentificationofpCanG-CiF3H(AanddetectionofCiF3HexpressionlevelintransgenicArabidopsisbyqRT-PCR0.20含量（mg·g-1FW）Content0.150.100.050丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆OE-15丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆转基因株系TransgeniclinesOE-23OE-36丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆WTOE图6野生型和转基因拟南芥总黄酮含量比较Fig.6ComparisonoftotalflavonoidscontentbetweenwildtypeandtransgenicArabidopsis2.7转基因拟南芥花青素含量变化黄烷酮-3-羟化酶（F3H）催化黄烷酮类底物（柚种植在不同钵中，为减少误差，在每个过表达株系钵中均种植野生型，检测结果表明转基因各株系花青素含量较野生型降低，说明在拟南芥中过表达CiF3H基因降低其花青素合成，可能使类黄酮合成途径转向其他支路。WTOE皮素）羟基化生成二氢黄酮醇类化合物，调控代谢途径中黄酮醇和花青素合成。本研究检测3个过表达株系花青素含量，结果见图7。3个过表达株系0.5含量（mg·g-1FW）Content0.40.30.20.10丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆OE-15转基因株系TransgeniclinesOE-23丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆OE-36丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆丆图7野生型和转基因拟南芥花青素含量比较Fig.7ComparisonofanthocyanincontentbetweenwildtypeandtransgenicArabidopsis
    第11期杨飞芸等：CiF3H基因克隆及功能分析·59·3讨论与结论3.1CiF3H基因对拟南芥类黄酮代谢的影响类黄酮代谢途径重要酶对植物体内类黄酮积累具有决定性作用。Tu等研究表明，红花CtF3H基因表达量增加使红花中山奈酚、芦丁等类黄酮含量增加[15]。Song等研究表明，将类黄酮代谢途径的重要酶在植物中异源表达引起该植物类黄酮代谢途径变化[14]。本研究克隆得到CiF3H基因经序列比对、系统进化分析发现其与大豆F3H基因亲缘关系最近，确定其为黄烷酮-3-羟化酶。将该基因转入野生型拟南芥，通过检测转基因拟南芥总黄酮含量分析其对拟南芥类黄酮代谢的影响。结果表明，CiF3H基因在拟南芥中大量表达，但3个转基因株系总黄酮含量较野生型少量增加。原因为本研究仅利用该代谢途径1个基因，作用不明显，总黄酮含量变化小。后续研究应采用同时转入该代谢途径多个重要基因方法确认。本研究结果显示转基因拟南芥总黄酮含量变化较小，为明确CiF3H基因在拟南芥类黄酮代谢中作用，同时检测转基因拟南芥花青素含量。结果表明，3个转基因株系花青素含量均低于野生型，说明CiF3H基因异源表达使拟南芥花青素合成降低。已知黄烷酮-3-羟化酶催化生成二氢黄酮醇类化合物可进一步生成黄酮醇或花青素，本研究中转基因拟南芥花青素生成量降低，但总黄酮含量增加，因此类黄酮合成途径可能转向黄酮醇合成支路，生成黄酮醇类化合物。此结果与Song等[14]研究结果相似。该研究将枸杞LcF3H基因在烟草中过表达发现，转基因烟草中总黄酮含量几乎不变，花青素含量明显降低，黄烷-3-醇含量明显增加。3.2CiF3H基因表达特性研究表明黄烷酮-3-羟化酶基因表达具有明显时空和组织特异性[13-14]。本研究检测CiF3H基因在中间锦鸡儿不同部位表达量发现，在不同部位其表达量差异较大。本研究结果显示CiF3H基因在叶和根中表达量相当，茎中相对较少。采自野外的组织中，CiF3H基因在种子中表达量高，花中表达量低。由于根、茎、叶采自实验室幼苗，花和种子采自野外自然生长植物，因此其生长条件、生长时间等不同，无法比较其表达量。总之，CiF3H基因表达具有明显组织特异性，与已有研究结果一致。3.3CiF3H基因对胁迫处理响应黄烷酮-3-羟化酶基因受不同胁迫处理诱导，如UV、干旱、温度、光照和NaCl等，引起植物体内黄酮醇、异黄酮和花青素等类黄酮含量改变，其抗氧化等抵御逆境能力发生变化[12,15-17]。本研究中间锦鸡儿CiF3H基因在紫外、NaCl和ABA等胁迫处理下，基因表达模式规律相同，即基因表达量均呈先降后升又降趋势。说明CiF3H基因在这3种处理下受诱导机制有共同之处，后续研究应深入探究其诱导表达机制。但3种胁迫处理下基因表达量变化不明显，说明中间锦鸡儿CiF3H基因为功能冗余基因，后续应克隆其同源基因验证。[参考文献][1]RecentShankerAK,ShankerC.Abioticandbioticstressinplants:[2]2016:advancesandfutureperspectives[M].London:IntechOpen,JoshidynamicR,185-227.KulkarniYA,WairkarS.Pharmacokinetic,pharmaco-LifeSciences,andformulations2018,215:43-56.aspectsofNaringenin:Anupdate[J].[3]JianghealthN,benefits[J].DoseffAPlants,I,Grotewold2016,5(2:E.Flavones:27.frombiosynthesisto[4]SantosbiosynthesisEL,MaiatohumanBHLhealth:NS,FerrianiChapterA1P,-Flavonoids:etal.Flavonoids-fromtion,biosynthesisandchemicalecology[M].London:IntechClassifica-Open,[5]2017:XiaE1-16.polyphenolsQ,DengfromGGrapes[J].F,GuoYInternationalJ,etal.BiologicalJournalofactivitiesMolecularof[6]FerreyraSciences,2010,11(2:622-646.logicalfunctionsMLF,RiusandSbiotechnologicalP,CasatiP.Flavonoids:applications[J].Biosynthesis,bio-[7]PlantPancheScience,2012,3:222.Frontiersin[8][J].JournalAN,ofDiwanNutritionalAD,Science,Chandra2016,SR.5(47:Flavonoids:1-15.AnoverviewSchijlenof[9]65(19:flavonoidEGbiosynthesisWM,VosCinHRcropD,Tunenplants[J].AJPhytochemistry,V,etal.Modification2004,Khumkarjorn2631-2648.expressionanalysisN,ThanonkeoofaflavanoneS,Yamada3-hydroxylaseM,etgeneal.Cloninginandorchid[J].JournalofPlantBiochemistryandBiotechnology,Ascocenda2016,
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