专题一 传统发酵技术的应用

课题一 果酒和果醋的制作

1、发酵：通过微生物技术的培养来生产大量代谢产物的过程。

2、有氧发酵：醋酸发酵 谷氨酸发酵 ·无氧发酵：酒精发酵 乳酸发酵

3、酵母菌是兼性厌氧菌型微生物真菌 ·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要) 分裂生殖 孢子生殖

4、在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖。 C6H12O6＋6O2＋6H2O→6CO2＋12H2O＋能量

5、在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。 C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2＋能量

6、酵母菌最适宜繁殖为20℃左右酒精发酵时一般将温度控制在18℃-25℃

7、在葡萄酒自然发酵的过程中,起主要作用的是附着在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在发酵过程中,随着酒精浓度的提高,红葡萄皮的色素也进入发酵液,使葡萄酒呈现深红色.在缺氧 呈酸性的发酵液中，酵母菌可以生长繁殖，而绝大多数其他微生物都因无法适应这一环境而受到制约。

8、醋酸菌是异养需氧型细菌(原核生物)

9、当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。 C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O

10、控制发酵条件的作用①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。③有两条途径生成醋酸：直接氧化和以酒精为底物的氧化。

11、实验流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）

12、酒精检验：果汁发酵后是否有酒精产生，可以用重铬酸钾来检验。在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。先在试管中加入发酵液2ｍL，再滴入物质的量浓度为3mol/L的H2SO43滴，振荡混匀，最后滴加常温下饱和的重铬酸钾溶液3滴，振荡试管，观察颜色的变化。

13、充气口是在醋酸发酵时连接充气泵进行充气用的；排气口是在酒精发酵时用来排出二氧化碳的；出料口是用来取样的。排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连接，其目的是防止空气中微生物的污染。开口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应该充气口连接气泵，输入氧气。

疑难解答

（1）你认为应该先冲洗葡萄还是先除去枝梗？为什么？

应该先冲洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗时引起葡萄破损，增加被杂菌污染的机会。

（2）你认为应该从哪些方面防止发酵液被污染？

如：要先冲洗葡萄，再除去枝梗；榨汁机、发酵装置要清洗干净，并进行酒精消毒；每次排气时只需拧松瓶盖，不要完全揭开瓶盖等。

（3）制葡萄酒时，为什么要将温度控制在18～25℃？制葡萄醋时，为什么要将温度控制在30～35℃？

温度是酵母菌生长和发酵的重要条件。20℃左右最适合酵母菌的繁殖。因此需要将温度控制在其最适温度范围内。而醋酸菌是嗜温菌，最适生长温度为30～35℃，因此要将温度控制在30～35℃。

课题二 腐乳的制作

1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。代谢类型是异养需氧型。生殖方式是孢子生殖。

2、原理：毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。

3、实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制

4、酿造腐乳的主要生产工序是将豆腐进行前期发酵和后期发酵。

前期发酵的主要作用：1.创造条件让毛霉生长。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。

后期发酵主要是酶与微生物协同参与生化反应的过程。通过各种辅料与酶的缓解作用，生成腐乳的香气。

5、所用豆腐的含水量为70％左右，水分过多则腐乳不易成形。

·毛霉的生长：条件：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15～18℃，并保持一定的温度。

·加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。

·用盐腌制时，注意控制盐的用量：盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味

·食盐的作用：1..析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，在后期制作过程中不会过早酥烂2.抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质3.增加咸味 4.食盐与氨基酸形成氨基酸钠使味道鲜美5.浸提毛酶菌丝上的蛋白酶。

·配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。酒精含量过高，腐乳的成熟时间将会延长（抑制蛋白酶活性，影响发酵）；酒精含量过低，不足以抑制微生物生长，可能导致豆腐腐败。

·酒的作用：1.抑制微生物生长 2.使腐乳具有独特的香味

·香辛料的作用：1.可以调制腐乳的风味 2.具有防腐杀菌的作用3.促进发酵

·防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水（酒精）消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰（杀菌），防止瓶口被污染。

疑难解答

（1）利用所学的生物学知识，解释豆腐长白毛是怎么一回事？

毛霉的白色菌丝，严格地说是直立菌丝。

（2）为什么要撒许多盐，将长毛的豆腐腌起来？

盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。

（3）我们平常吃的豆腐，哪种适合用来做腐乳？

含水量为70%左右的豆腐适于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。

（4）吃腐乳时，你会发现腐乳外部有一层致密的“皮”。这层“皮”是怎样形成的呢？它对人体有害吗？它的作用是什么？

豆腐上生长的匍匐菌丝。对人体无害。它能使腐乳成形。

课题三 制作泡菜

1.制作泡菜所用微生物是乳酸菌，乳酸菌是异养厌氧型细菌（原核生物）。在无氧条件下，降糖分解为乳酸。常见的乳酸菌有乳酸链球菌和乳酸杆菌。

2.亚硝酸盐为白色粉末，易溶于水，在食品生产中用作食品添加剂。

3.膳食中的亚硝酸盐一般不会危害人体健康，国家规定肉制品中不超过30mg/kg，酱腌菜中不超过20mg/kg，婴儿奶粉中不超过2mg/kg。亚硝酸盐被吸收后随尿液排出体外，但在适宜pH 、温度和一定微生物作用下形成致癌物质亚硝胺。

4.泡菜的制作

·按照清水与盐的质量比为4：1的比例配置盐水，将盐水煮沸冷却（加热煮沸是为了杀灭杂菌除去O2，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响）。

·泡菜坛应选用火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的泡菜坛。

·腌制的条件：在泡菜的腌制过程中，要注意控制腌制的时间、温度和食盐的用量。温度过高、食盐的用量过低、腌制的时间过短，容易造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。一般在腌制10d后，亚硝酸盐的含量开始下降

疑难解答

（1）为什么日常生活中要多吃新鲜蔬菜，不宜多吃腌制蔬菜？

在腌制过程中，蔬菜中的硝酸盐会被微生物还原成亚硝酸盐，危害人体健康

（2）为什么泡菜坛内有时会长一层白膜？你认为这层白膜是怎么形成的？

形成白膜是由于酵母的繁殖，它是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。

专题二 微生物的培养与应用

课题一 微生物的实验室培养

1.培养基：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质，是进行微生物培养的物质基础。

2.培养基按物理状态分为液体培养基 半固体培养基和固体培养基，按功能来分分为选择培养基和鉴别培养基。

3.培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。

4.碳源：能为微生物的代谢提供碳元素的物质。如CO2、NaHCO3等无机碳源；糖类、石油、花生粉饼等有机碳源。异养微生物只能利用有机碳源。单质碳不能作为碳源。

5.氮源：能为微生物的代谢提供氮元素的物质。如N2、NH3、NO3-、NH4+（无机氮源）蛋白质、氨基酸、尿素、牛肉膏、蛋白胨（有机氮源）等。只有固氮微生物才能利用N2。

6.培养基还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。例如，培养乳酸杆菌时需要在培养基中添加维生素，培养霉菌时须将培养基的pH调至酸性，培养细菌是需要将pH调至中性或微碱性，培养厌氧型微生物是则需要提供无氧的条件

7.无菌技术

·获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，要注意以下几个方面：

2 实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。

②将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌。

③为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。

④实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。

无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？

答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。

·消毒与灭菌的区别

消毒指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物（不包括芽孢和孢子）。消毒方法常用煮沸消毒法，巴氏消毒法（对于一些不耐高温的液体）还有化学药剂（如酒精、氯气、石炭酸等）消毒、紫外线消毒。

灭菌则是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。

灭菌方法：

①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱 ；

③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅 。

④表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯 。

8.制作牛肉膏蛋白胨固体培养基

（1）方法步骤：计算、称量、溶化、调节pH、灭菌、倒平板(冷却至50°C)。

（2）倒平板操作的步骤：

①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。

②右手拿锥形瓶，将瓶口迅速通过火焰。

③用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约10～20mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

④等待平板冷却凝固，大约需5～10min。然后，将平板倒过来放置，使培养皿盖在下、皿底在上。

·倒平板操作的讨论

1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？

用手

2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？

通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。

3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？

平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，也可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？

不能。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生

9.纯化大肠杆菌

（1）微生物接种的方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

（2）由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

（3）稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。

（4）用平板划线法和稀释涂布平板法接种的目的是：使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落，以便于纯化菌种。

（5）平板划线法操作步骤：

①将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。

②在火焰旁冷却接种环，并打开棉塞。

③将试管口通过火焰。

④将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环菌液。

⑤将试管通过火焰，并塞上棉塞。

⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养皿。

⑦灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。

⑧将平板倒置放入培养箱中培养。

·平板划线操作的讨论

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？

杀死上次结束时的杂菌。需要，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和操作者

2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？

以免接种环温度太高而杀死菌种。

3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？

线条末端细菌数较少，这样细菌的数目随着次数的增加而逐渐减少，最终能得到由单个细菌而繁殖而来的菌落。

（6）涂布平板操作的步骤：

①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。

②取少量菌液，滴加到培养基表面。

③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8～10s。

④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

10.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37°C恒温箱中。

11.菌种的保存

（1）对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

①临时保藏方法

将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，在合适的温度下培养。当菌落长成后，将试管放入4℃的冰箱中保藏。

②缺点：这种方法保存的时间不长，菌种容易被污染或产生变异。

（2）对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

在3mL的甘油瓶中，装入1mL甘油后灭菌。将1mL培养的菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20℃的冷冻箱中保存。

课题二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1.尿素是一种重要的农业氮肥，尿素并不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为他们能合成脲酶

尿素最初是从人的尿液中发现的

·筛选菌株

（1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

·统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低（这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的只是一个菌落），因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

采用此方法的注意事项：一般选取菌落数在30~300之间的平板进行计数

·实验设计

实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

（1）土壤取样：土壤有“微生物的天然培养基”之称。土壤中的微生物，大约在70%~90%是细菌。从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）样品的稀释：样品的稀释程度将直接影响平板上生长的菌落数目。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30~300之间、适于计数的平板。

测定土壤中细菌的数量，一般选用104 、105 、106

测定放线菌的数量，一般选用103、104 、105

测定真菌的数量，一般选用102、103、104

（3）微生物的培养与观察

每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。一般来说，在一定的培养条件下（相同的培养基、唯独及培养时间），同种微生物表现出稳定的菌落特征；形状、大小、隆起程度、颜色

课题延伸

氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应是否发生。在一尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红试剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红

疑难解答

每克样品中的菌落数=（C/V）*M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积（ml），M代表稀释倍数

课题三 分解纤维素的微生物的分离

1.纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。

（一）纤维素与纤维素酶

（1）棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

（2）纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养。

（二）纤维素分解菌的筛选

（1）筛选方法：刚果红染色法。能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

（2）刚果红染色法筛选纤维素分解菌的原理

刚果红是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

（三）分离分解纤维素的微生物的实验流程

（1）土壤采集:选择富含纤维素的环境。

（2）刚果红染色法分离纤维素分解菌的步骤倒平板操作、制备菌悬液、涂布平板

（3）刚果红染色法种类,一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。

课题延伸

为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。纤维素酶的测定方法，一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

疑难解答

（1）两种刚果红染色法的比较

方法一。优点：颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用；缺点：操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂

方法二。优点：操作简便，不存在菌落混杂问题；缺点：产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。

（2）为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制

专题三 植物的组织培养技术

课题一 菊花的组织培养

(一）植物组织培养的基本过程

1.细胞分化：在生物个体发育过程中，细胞在形态、结构和生理功能上出现稳定性差异的过程。

2.离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织，愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。再分化形成的试管苗，移栽到地里，可以发育成完整的植物体。

(二)影响植物组织培养的条件

1.外植体的选择

（1）不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易。（2）同一种植物材料、材料的年龄和保存时间的长短等都会影响实验结果。菊花组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。

（3）一般选择植物生长旺盛的部位。

2.MS培养基

大量元素是N、P、S、K、Ca、Mg；

微量元素是Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、I、Co；

有机物有甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等。

植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。

可见，植物激素的浓度、使用先后顺序以及用量的比例都会影响实验结果

3环境条件

PH、温度、光等环境条件。

不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行菊花的组织培养，一般将pH控制在5.8左右，温度控制在18~22℃，并且每日用日光灯照射12h.

实验操作

（一）配制MS固体培养基：

（1）配制各种母液： 配制母液时，无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍

（2）配制培养基：由于菊花茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素

（3）灭菌：采取的灭菌方法是高压蒸汽灭菌。

（二）外植体的消毒

外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。

选取菊花茎段时，要取生长旺盛的嫩枝。菊花茎段用流水冲洗后可加少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右。用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70%的酒精中摇动2~3次，持续6~7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗。取出后仍用无菌吸水纸吸干外植体表面水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中1~2min。取出后，在无菌水中至少清洗3次，漂洗消毒液。

注意：对外植体进行表面消毒时，就要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。

（三）接种：接种前用体积分数为70%的酒精将工作台擦拭一遍。工作台消毒后，首先点燃酒精灯。此后，所有的接种操作都必须在酒精灯旁进行，并且每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌

（四）培养：应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒。培养温度控制在18~22°C，并且每日用日光灯光照12h

（五）移栽：栽前应先打开培养瓶的封口膜，让其在培养间生长几日，然后用流水清洗根部培养基。然后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中生活一段时间，进行壮苗。最后进行露天栽培。

（六）栽培

外植体在培养过程中可能会被污染，原因有外植体消毒不彻底；培养基灭菌不彻底；接种中被杂菌污染；锥形瓶密封性差等。

专题二 月季的花药培养

（一）被子植物的花粉发育

被子植物的雄蕊通常包含花丝、花药两部分。花药为囊状结构，内部含有许多花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此，花粉是单倍体的生殖细胞。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段。在小孢子四分体时期，4个单倍体细胞连在一起，进入单核期时，四分体的4个单倍体细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒。这时的细胞含浓厚的原生质，核位于细胞的中央（单核居中期）。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧（单核靠边期），并分裂（有丝分裂）成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将再分裂（有丝分裂）一次，形成两个精子。

注意：①成熟的花粉粒有两类，一类是二核花粉粒，其花粉粒中只含花粉管细胞核和生殖细胞核，二核花粉粒的精子是在花粉管中形成的；另一类是三核花粉粒，花粉在成熟前，生殖细胞就进行一次有丝分裂，形成两个精子，此花粉粒中含有两个精子核和一个花粉管核（营养核）②花粉发育过程中的四分体和动物细胞减数分裂的四分体不同。花粉发育过程中的四分体是花粉母细胞经减数分裂形成的4个连在一起的单倍体细胞；而动物细胞减数分裂过程中的四分体是联会配对后的一对同源染色体，由于含有四条染色单体而称为四分体。③同一生殖细胞形成的两个精子，其基因组成完全相同。

（二）产生花粉植株的两种途径

通过花药培养产生花粉植株（即单倍体植株）一般有两种途径，一种是花粉通过胚状体阶段发育为植物，另一种是花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。

注意： 某些体细胞在形态上转变为与合子发育成的胚非常相似的结构，它的发育过程也与合子胚类似，胚芽、胚根、胚轴等完整结构，就像一粒种子。科学家将这种结构称做体细胞胚或细胞胚。

（三）影响花药培养的因素

诱导花粉能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素

·不同植物的诱导成功率很不相同。亲本植株的生理状况对诱导成功率也有直接影响。选择适合的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定影响

·合适的花粉发育时期：一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期（单核靠边期），花药培养成功率最高。选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期以后的花药接种，花瓣已有些松动。

·花蕾：选择完全未开放的花蕾

实验操作

（一）材料的选取

选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。确定花粉发育时期的最常用的方法是醋酸洋红法。但是，某些植物的花粉细胞核不易着色，需采用焙花青-铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色

（二）材料的消毒

通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡大约3s，立即取出，在无菌水中清洗。取出后再用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分，放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4min（也可用质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液），取出后再用无菌水冲洗3～5次。

（三）接种和培养

消毒过后后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上。在剥离花药时，要尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位长生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成。通常每瓶接种花药7～10个,培养温度控制在25℃左右,不需要光照.幼小植株形成后才需要光照。一般经过20～30天培养后,会发现花药开裂,长出愈伤组织或形成胚状体。将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，染色体组的数目常常会发生变化。因此还需对培养出来的植株做进一步的鉴定和筛选（可以进行临时装片）。