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铁皮石斛多糖提取工艺优化研究

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浙江科技学院学报，第２８卷第６期，２０１６年１２月　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ＿２８　Ｎｏ．６，Ｄｅｃ．２０１６　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７１－８７９８．２０１６．０６．００６　铁皮石斛多糖提取工艺优化研究　吴　迪　，蔡成岗　，沙如意　（１．浙江科技学院生物与化学工程学院，杭州３１００２３；２．浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，杭州３１００２３；　３．浙江省农业生物资源生化制造协同创新中心，杭州３１００２３）　摘　要：多糖为铁皮石斛中的主要有效成分，高效浸出有利于其进一步利用。以水为溶剂，对影响铁皮石斛多糖　提取的时间、温度及料液质量比等因素进行了优化研究，并应用苯酚一硫酸法和ＤＮＳ法考察了铁皮石斛提取液总　糖和单糖的提取率，多糖提取率由两者之差计算得出。单因素实验和正交实验结果表明，料液质量比１：１２０、浸　提温度７Ｏ℃、浸提时间９０　ｍｉｎ时提取铁皮石斛多糖效果最好，在此工艺条件下，铁皮石斛多糖提取率为５５．２　。　关键词：铁皮石斛；多糖；提取工艺；单因素实验；正交实验　中图分类号：Ｒ２８４．２　文献标志码：Ａ　文章编号：１６７１—８７９８（２０１６）０６～０４４４—０６　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ０ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　Ｍｉｇｏ　ＷＵ　Ｄｉ　。ＣＡＩ　Ｃｈｅｎｇｇａｎｇ　＇　～，ＳＨＡ　Ｒｕｙｉ　’。“　（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｚｈｅｊ　ｉａｎｇ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２３’，Ｃｈｉｎａ；２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ　Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｆａｒｍ　Ｐｒｏｄｕｃｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２３，Ｃｈｉｎａ；３．Ｚｈｅｊｉａｎｇ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　ｆｏｒ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００２３，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｍｏｓｔ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ　ｉｎ　Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　Ｍｉｇｏ，ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄ．０ｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　Ｍｉｇｏ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｓｕｃｈ　ａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｆｒｏｍ　Ｄ．ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　Ｍｉｇｏ　ｂｙ　ｗａｔｅｒ　ｕｓｉｎｇ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．Ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｗａｓ　ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ｓｕｂｔｒａｃｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｔｏｔａｌ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ａｎｄ　ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ｗｈｉｃｈ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｐｈｅｎｏｌ　ｓｕｌｆｕｒｉｃ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ＤＮＳ　ｍｅｔｈｏｄ，　２Ｏ１６—１Ｏ一２２　收稿日期：　基金项目：　国家级大学生创新创业训练计划项目（２０１６１１０５７０１４）；浙江科技学院科研启动基金项目（７０２１０３Ｅ０３）　作者简介：　吴迪（１９９４　），男，浙江省湖州人，２０１４级生物工程专业本科生。　通信作者：　蔡成岗，副教授，博士，主要从事食品生物技术研究。　
第６期　吴迪，等：铁皮石斛多糖提取工艺优化研究　４４５　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｉｎｇｌｅ｛ａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　ｔｏ　ｗａｔｅｒ　ｏｆ　１：１２０，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｆ　７０℃ａｎｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｉｍｅ　ｏｆ　９０　ｍｉｎ　ａｒｅ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ａｌｓｏ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．Ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉａｌｍ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｔｈｅ　ｍａｘｉｍａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｑｕａｎｔｉｔｙ　ｉｓ　ｏｆ　５５．２　９，５．　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　Ｍｉｇｏ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　铁皮石斛（Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ　ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ　Ｋｉｍｕｒａ　ｅｔ　Ｍｉｇｏ）是中国传统名贵中药，历代古籍医书均有记载。　《本草纲目》载：“俗方最以补虚，主治伤中，除痹下气，补五脏虚劳赢瘦，强阴益精；厚肠胃，补内绝不足，逐　皮肤邪热瘁气，治男子腰脚软弱，健阳，补肾益力，壮筋骨，暖水脏，轻身延年等”；《本昌思辨录》认为，石　斛，为肾药，为肺药，为肠胃药ｎ］。铁皮石斛具养胃生津、润肺止咳、滋阴清热、清音明目之功效，含有多　糖、生物碱、菲类、联苄类、芴酮化合物、糖苷类、氨基酸等药理成分　－８］。多糖作为铁皮石斛的主要有效成　分，药理作用包括增强机体免疫能力、抗氧化、抗衰老、降血糖、养阴生津和抑制肿瘤等　引。　近年来，铁皮石斛人工栽培面积逐步扩大，受到广泛的关注。其药用主要成分多糖的提取对于铁皮　石斛的高效利用和产品开发具有重要意义。目前，国内有研究人员针对铁皮石斛多糖采用水法提取［１　、　酶法提取［１　７－１９］、超声波提取　。　等，其中酶法及超声提取法较直接水提法效果更好，多糖质量浓度因铁皮　石斛采收季节及生长年份不同而存在一定的差异；在提取实验设计中，采用正交实验＿２妇和响应面分　析［１６，１９］等设计方法，获得了较佳的提取工艺。因铁皮石斛主要在中国栽培，国外对其研究报道较少。鉴　于目前铁皮石斛多糖提取工艺条件存在一定的差异，本研究为探讨铁皮石斛中多糖的质量浓度，采用单　因素和正交实验方法对铁皮石斛多糖进行了提取的工艺优化研究，以期为掌握铁皮石斛中多糖的质量浓　度并为后续多糖的构效关系等研究提供一定的参考。　１　实验方法　１．１实验材料　铁皮石斛，购自市场，为３年生铁皮石斛鲜条。葡萄糖、浓硫酸、苯酚、酒石酸钾钠、３，５一二硝基水杨　酸、氢氧化钠、亚硫酸氢钠等均为分析纯，购自华东医药股份有限公司器材化剂分公司；水为去离子水。　１．２实验设备　水浴锅，江苏金坛良友实验仪器厂；台式高速冷冻离心机，德国希格玛（ＳＩＧＭＡ）公司；粉碎机，天津　市泰斯特仪器有限公司；紫外可见分光光度计（ＵＶ～５５００ＰＣ），上海元析仪器有限公司；电子天平　（ＰＬ３０３），梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司。　１．３提取工艺　石斛鲜条一切碎一６Ｏ℃烘干一磨粉一过筛一称样一水浴提取一定容一离心一上清液备用一糖质量浓度　测定。　１．４糖浓度测定　单糖质量浓度测定采用ＤＮＳ法　（３，５－二硝基水杨酸比色法），总糖质量浓度测定采用苯酚一硫酸　法口　，多糖提取率以总糖提取率减去单糖提取率进行计算。　１＿４．１　ＤＮＳ法　分别取标准溶液Ｏ、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０　ｍＬ于２５　ｍＬ试管中，分别准确加入ＤＮＳ试剂２　ｍＩ　，沸　水浴加热２　ｍｉｎ，流水冷却，用水补足到２５　ｍＬ，在５４０　ｎｍ波长下测定吸光度值，以质量浓度为横坐标、吸　光度为纵坐标绘制标准曲线，并建立方程。　１．４．２苯酚硫酸法　分别取标准溶液０．２、０．４、０．６、０．８、１．０　ｍＬ，各以水补至２．０　ｍＬ，然后先后加入１．０　ｍＬ苯酚（５　质量　
４４６　浙江科技学院学报　第２８卷　浓度）和５．０　ｍＬ浓硫酸，混合后静置１０　ｍｉｎ，摇匀并于室温下放置２０　ｍｉｎ，于４９０　ｎｍ下测定吸光度值，空白　实验以１．０　ｍＬ水代替样品进行，并绘制吸光度为纵坐标、葡萄糖质量浓度为横坐标的标准曲线，建立回归　方程。　１．５单因素实验　１．５．１　料液质量比的确定　精密称取０．２　ｇ铁皮石斛粉末，在浸提温度６０℃、浸提时间９０　ｎ／ｎ条件下，研究１：９Ｏ、１：１２０和１：１５０　料液质量比对提取效果的影响。　１．５．２　浸提温度的确定　精密称取０．２　ｇ铁皮石斛粉末，在最佳料液质量比条件下，以蒸馏水为溶剂，在５Ｏ、７Ｏ、９Ｏ℃温度下　浸提９０　ｍｉｎ，测定提取效果。　１．５．３　浸提时间的确定　精密称取０．２　ｇ铁皮石斛粉末，在最佳料液质量比和浸提温度条件下，以蒸馏水为溶剂，研究浸提时　间６Ｏ、９０、１２０　ｒａｉｎ对铁皮石斛多糖提取效果的影响。　１．６正交实验　以单因素实验得出的最佳料液质量比、浸提温度和浸提时间为中心点，设计正交实验，因素和水平如　表１所示。　表１正交实验因素和水平　Ｔａｂｌｅ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｌｅｖｅｌｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　２结果与讨论　２．１标准曲线　２．１．１　ＤＮＳ法标准曲线　ＤＮＳ法标准曲线方程为　一０．７４２ｘ＋０．０１５（Ｒ。一０．９９８，Ｒ为相关系数），该线性方程说明在图１所　示的质量浓度范围内葡萄糖质量浓度与吸光度有良好的线性关系。　２．１．２苯酚一硫酸法标准曲线　苯酚一硫酸法标准曲线方程为ｙ一０．８７６ｘ＋０．０２７（Ｒ。一０．９９７），该线性方程说明在图２所示的质量　浓度范围内葡萄糖质量浓度与吸光度有良好的线性关系。　０　０．２　０．４　０．６　Ｏ　８　１．０　１．２　２　葡萄糖质量浓度　ｍｇ・ｍＬ　）　葡萄糖质量浓度／（ｍｇ・ｍＬ　）　图１　ＤＮＳ法测定还原糖标准曲线　图２苯酚一硫酸法测定总糖标准曲线　Ｆｉｇ．１　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｆｏｒ　ｒｅｄｕｃｉｎｇ　Ｆｉｇ．２　Ｓｔａｎｄａｒｄ　ｃｕｒｖｅ　ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＤＮＳ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ｐｈｏｎｅｌ—ｓｕｌｆａｔｅ　ｍｅｔｈｏｄ　

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