学士学位毕业论文

学号：20104084112

兔病毒性出血症、巴氏杆菌病

二联灭活苗的研究和制备

学生姓名：刘卫贞

指导教师：余丽芸老师

所在学院：生命科学技术学院

专 业：制药工程（1）

中国·大庆

2014 年 5 月

黑龙江八一农垦大学

本科生毕业论文任务书

兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗

的研究和制备

摘要：取攻毒后濒死兔或死亡兔的肝、脾、肾，经研磨、过滤、灭能制作兔病毒性出血症组织灭活毒液；用兔巴氏杆菌菌种接种在鲜血马丁琼脂（马丁肉汤），上制成菌液；将上述二者灭活后按比例混合，利用氢氧化铝胶作为佐剂，制成二联灭活苗。对产品进行无菌检验、安全试验和免疫效果检验，结果均合格。

关键词：兔病毒性出血症；巴氏杆菌病；铝胶；二联苗

The research and preparation of the double vaccine of rabbit viral hemorrhage disease and pasteurellosis in rabbit

Abstract: Inactivation tissue liquid were made using the liver ,spleen and kidney from the death or dying rabbits challenged with rabbit Hemorrhage disease virus. Blood Mattin’s Broth or Mattin’s agarose was seeded with rabbit pasteurellosis in order to made inactive bacterial. These two inactive virus and bacteria were mixed in proportion and Al(OH)3 were added as adjuvant .This double vaccine were tested by asepsis test ,security test and immunity test.

Key words : Rabbit viral hemorrhage disease；Pasteurellosis in rabbit；gelatin alumina；the double vaccine

目 录

前言 1

1材料和方法 1

1.1 菌（毒）种 1

1.2 试验动物 1

1.3 培养基 1

1.4 氢氧化铝按常规方法制备 2

2 疫苗的制备 2

2.1 菌（毒）液的制备 2

2.2 疫苗配制 3

3 疫苗的检验结果 4

3.1 无菌检验 4

3.2 安全试验 4

3.3 效力检验 4

4 结论 4

5 讨论 4

5.1 4

5.2 5

5.3 5

5.4 5

参考文献 6

致谢 7

前言

兔病毒性出血症又名兔出血性肺炎、兔出血症和兔瘟。是由兔病毒性出血症病毒所致的兔的一种急性、败血性、高度接触传染性、致死性和以全身实质器官出血为主要特征的传染病。本病的主要传染源是病兔和带毒兔。传播途径主要由病兔或带毒兔与健康兔接触而感染，也可通过被排泄物、分泌物等污染的饲料、饮水、用具、空气、兔毛以及人员来往间接传播。本病发病急，病死率高，常呈暴发性流行，传播迅速，几天内危及全群。发病率和病死率均高达95%以上。潜伏期自然病例为2-3天，人工感染为1-3天[1]。

兔巴氏杆菌病是一种多杀性疾病，急性病例引起患兔发生急性败血性疾病，发病率和死亡率均很高，因本病药物治疗效果不佳，兔场一旦发生巴氏杆菌病就很难根除，因此使用疫苗便成了控制本病的一条行之有效的办法。家兔中较常发生，一般无季节性。病兔的粪便、分泌物可以不断排出有毒力的病菌，污染外界环境，或由咳嗽、喷嚏排出病菌，通过飞沫经呼吸道而传染。临诊特征是鼻炎、地方流行性肺炎、全身性败血症、中耳炎、结膜炎、子宫积脓、睾丸炎等不同病型。此病是引起9周龄～6月龄兔死亡的一种最主要的传染病。

做好以上二种疾病的预防工作，直接关系到养兔业的成败。过去是用单一苗，每苗一注，抓兔、打针对胆小的兔子是强烈的刺激。为了降低大批量的成本、减少捕捉注射次数、将对兔子的应激反应降到最低，开展了以氢氧化铝为佐剂的兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗的研究和制备工作。这样，既简化了制作过程，又降低了成本，也为现地应用节省了人力和物力。

1 材料和方法

1.1 菌（毒）种

兔病毒性出血症病毒毒种、兔巴氏杆菌冻干菌种均由黑龙江省生物制品一厂提供。

1.2 试验动物

非免疫兔由黑龙江省哈药生物疫苗试验动物室提供。

1.3 培养基[2]

鲜血马丁琼脂、马丁肉汤。

1.3.1 鲜血马丁琼脂培养基配方及制法

培养基主要成分有牛肉汤500ml，猪胃消化液500ml，氯化钠2.5g，琼脂粉12g。将上述成分混合,加热溶解，待琼脂完全溶化后,加氢氧化钠溶液调整PH为7.4-7.6以卵白澄清法或凝固沉淀法除去沉淀，分装于试管或中性玻璃瓶中, 116℃灭菌30-40min。灭菌后PH值应为7.2-7.6。

根据需求在上述琼脂液冷却至53-55℃时,加入4%健康动物血清0.1%裂解血球全血,充分混合后,分装于灭菌平板或试管中,制成含4%健康动物血清和0.1%裂解血的鲜血马丁琼脂。

1.3.2 马丁肉汤培养基的配方及制法

培养基主要成分有牛肉汤500ml，猪胃消化液500ml，氯化钠2.5g。将上列成分混合后，以氢氧化钠溶液调整pH为7.6-7.8,煮沸20-40min,补足失去的水分.冷却沉淀,抽取上清液,经滤纸或绒布滤过,滤液应为澄清、淡黄色，按需要量分装，经116℃灭菌30-40min，灭菌后pH值应为 7.2-7.6。

1.4氢氧化铝胶的制备

制备氢氧化铝胶的时候，选用三氯化铝与氢氧化钠合成的方法[3]。其反应原理的化学反应式为：AlCl3+3NaOH→Al(OH)3↓+3NaCl。制造时，先将无水三氯化铝用去离子水配成25％溶液，加热溶化，使用时再稀释成8％，加温至56-60℃。另将氢氧化钠配成4％溶液，加温至56-60℃。化学合成时，将三氯化铝溶液放入反应缸，维持温度60℃，边搅拌边缓慢加入氢氧化钠溶液，当化合液pH达到5.6-6.0时，即为终点，继续搅拌10min，分装，121℃高压灭菌30min，灭菌后的铝胶液为透明略带乳光液体，pH 5.5±0.1。此法合成的铝胶虽然含量低，但胶体透明无沉淀，目前广泛用于制备人用生物制品，认为佐剂效果良好，注射部位无硬结反应。

2 疫苗的制备

2.1 菌（毒）液的制备

2.1.1 兔病毒性出血症组织灭活液的制备

（1）兔病毒性出血症病毒在兔体内的增殖

为了获得高滴度病毒组织，应选择体重1.5Kg以上健康易感家兔，接种的种毒为生产用毒种(符合其作为毒种的标准[4])，种毒用无菌生理盐水作10倍稀释，病毒接种量为每只家兔皮下注射2ml。收毒时取接种后24－96h内濒死或刚死亡的家兔，无菌采取肝、脾、肾、心、肺等备用。

（2）兔病毒性出血症组织液的制备与灭活

已采取濒死或死亡兔的肝脏、脾脏和肾脏，按组织与盐水1:5的比例进行研磨、过滤，然后按乳剂重量的0.4％加入甲醛溶液，混匀，置37℃灭活48h，期间振摇5-6次/d[5]。

（3）灭活检验

兔病毒性出血症病毒组织悬液灭活后取样，接种体重1.5kg以上的家兔2只，每只皮下注射4ml，观察3d。

2.1.2 巴氏杆菌灭活菌液的制备

（1）一级种子的繁殖

将冻干菌种接种于含0.1%裂解血马丁肉汤中，置36-37℃培养24h，然后划线接种于含0.1%裂解血及改良的含有4%健康动物血清的马丁琼脂平板上，选5个以上典型菌落(表面光滑，呈微蓝色；在低倍显微镜下，45度折光观察，菌落结构细致边缘整齐，呈桔黄色，属Fo菌落型)。接种鲜血琼脂斜面若干支，置36-37℃培养20h,作为一级种子。在2-8℃保存。使用期不超过14d。在培养基上连续传代，不超过5代。

（2）二级种子繁殖

取一级种子接种在含0.1％裂解血的马丁肉汤中，置37℃培养24h，纯粹检验合格后，置2-8℃保存.,使用期不超过4d。

（3）制苗用培养基

为马丁肉汤,制造方法见1.3.2。

（4）菌液制备

①菌液培养

用培养瓶通气培养,按培养瓶容积的70%加入培养基及消泡剂,灭菌后按培养基量的1%-2%接种二级种子液,并加入0.1%裂解血,用逐渐增大通气量的方法,于37-39℃培养18h。

②纯粹检验及活菌计数　

菌液培养完成后,取样，用血液马丁琼脂作纯粹检验,同时作活菌计数。

③灭活

按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液，经37℃灭活24h，中间摇瓶3-5次，然后作灭活检验，应无菌生长。

2.2 疫苗配制[6]

将检验合格的巴氏杆菌灭活菌液，以无菌氢氧化钠溶液将pH值调至6.8-7.2，然后分别按巴氏杆菌菌液9份加灭菌氢氧化铝胶1份的比例充分混合，置2-8℃，巴氏杆菌菌液静置2-3d，弃全量1／2的上清液，然后将兔病毒性出血症病毒液、巴氏杆菌浓缩菌液按1:1[7]的比例混和，并按总量的0.005％加入硫柳汞，混匀，组批，定量分装。

3 疫苗的检验结果

3.1 无菌检验

将疫苗分别接种于鲜血马丁琼脂、鲜血马丁肉汤中，置37℃培养72h，均未见细菌生长。

3.2 安全性试验

疫苗经皮下或肌肉接种4只体重为2kg左右的健康易感兔，4ml/只，观察10d，检验兔全部存活，注苗后7d扑杀个别免疫兔，除在免疫部位有少许未吸收的疫苗外，其它未见异常变化。

3.3 效力试验

用体重l.5-2kg家兔8只，各皮下注射疫苗2ml，在免疫14-21d内，连同条件相同的对照兔8只，按下述方法进行攻击试验。

在免疫后10-14d，取试验兔4只，连同对照兔4只，各皮下注射10倍稀释的兔病毒性出血症强毒（肝、脾毒）lml，观察 7d，对照兔死亡3只，免疫兔全部健活。

在免疫后14-21d，取试验兔4只，连同对照兔4只，各皮下注射1个致死量兔多杀性巴氏杆菌强毒，观察8d，对照兔死亡3只，免疫兔保护4只。

统计如下表：

注：免（免疫组），对（对照组）。

4 结论

由于本苗制备过程中，确保了疫苗的含毒量及菌数，以保证疫苗的免疫效果。目前，市场出售的兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联疫苗多未进行浓缩，家兔接种剂量较大，这给用户使用带来了许多不便，本疫苗浓缩后每只家兔每次只需接种1ml疫苗，不仅免疫效果未受影响，而且还具有使用方便，副作用小等优点。

5 讨论

5.1 兔病毒性出血症、巴氏杆菌病是家兔的二种常发疾病，用药物难以控制，应用兔病毒性出血症、巴氏杆菌病二联灭活苗可有效防制这二种疾病的发生。实践证明，幼兔在首免后14d，再加强免疫一次，种兔接种疫苗2-3ml/只，其免疫效果将会更为理想。

5.2 本疫苗是一种联合疫苗，其优势可以概括为经济、高效、方便、安全四个词，使用它可降低成本，其产生的免疫应答和保护性抗的效率要比单独接种高又可避免和减少多次接种引起的动物的应激反应。目前国际上正在研制许多联合疫苗，其中一些免疫效果较理想的疫苗已应用于人体[8]。

5.3 本疫苗使用氢氧化铝胶作为佐剂，其主要功能为缓释，但同时具有对免疫细胞的激活作用。将蛋白质和氢氧化铝或混合注射，能够使抗原保存在注射部位，即“库存效应”，具有抗原缓释和非特异免疫刺激作用。大量的临床免疫试验认为氢氧化铝胶体佐剂对TH2介导的体液免疫反应具有很强的激发作用，而对TH1介导的细胞免疫反应的作用较弱。此外，该种佐剂不适合作为肽抗原的佐剂。同其它佐剂一样，铝盐佐剂并不适合所有的抗原，与有些抗原混合注射后会引起局部炎症反应，有时还会形成肉芽肿。任何一种佐剂或疫苗的安全性都是I期临床实验的主要检测内容。可增强Th2型免疫应答和体液免疫[9]，而且对疫苗起到良好的保护作用，但它易诱发过敏反应。如今，新型疫苗佐剂不断问世。含有细菌CpG基序[10]的寡核苷酸（CpGODN[11]），不仅具有免疫激活作用，还可提高疫苗的免疫效应，弥补了常规佐剂的很多不足。

5.4 在攻击试验中，对照组也注射了致死量的病毒，但是依然有试验兔存活，从理论上来讲，可能是这两只兔子在实验之前就得过兔病毒性出血症、巴氏杆菌病，身体里已经产生了免疫，因此得以存活。

参考文献

[1]颜淑芹．实验家兔群体死亡原因的分析[J]．中国生物制品学杂志，2004，17(3)：183

[2]王宪文，王新卫．兽医生物制品制备技术[M]． 中国农业科学技术出版社，2007，4－8

[3]姜平．兽医生物制品学（第二版）[M]．中国农业大学出版社，2003，52

[4]中华人民共和国兽医生物制品规程2000年版，98

[5] 吴强等．兔瘟、巴氏杆菌病、魏氏梭菌病三联铝胶灭活苗的研制[J]．畜牧兽医科技，2005，3，27

[6]邢钊，张健，范琳等．兽医生物制品实用技术[M]．中国农业大学出版社，2000，370－372

[7]徐为中, 薛家宾，王启明等. 兔病毒性出血症、巴氏杆菌病、产气荚膜梭菌病三联浓缩灭活疫苗的研制[J]．中国家畜传染病学分会五届九次研讨会论文集，1038

[8]庄敏，李迪．联合疫苗的研究进展[J]．国外预防诊断治疗用生物制品分册，2004，6，27（3）：102

[9]李秀真．新型疫苗佐剂[J]．国外预防诊断治疗用生物制品分册，2004，6，27（3）：97－99

[10] Krieg AM，Yi AK，Matson S．et al．CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation [J]．Nature，1995，374：546

[11]Ballas ZK，Rasmussen WL，Krieg AM．Induction of NK activity in murine and human cells by CpG motifs in oligodeoxynudeotides and bacterial DNA [J]．J Immunol，1996，157：1840

致 谢

本论文得以完成，在此特别感谢黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院副院长余丽芸博士在此期间给予我的细微的帮助和莫大的支持，感谢我的师姐徐超、师姐岳麓对我热情的帮助，同时感谢黑龙江省兽医研究所于万才副研究员对我细心指导，感谢黑龙江省生物制品一厂给与我大力支持和帮助，最后感谢我的母校黑龙江八一农垦大学对我的栽培，并给我这个机会来展示我四年所学所得。

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